蛋白質復性後不結合離子交換柱
① 什麼叫蛋白質的復性
蛋白質的復性
蛋白質復性的最大問題，是在復性過程中形成中間體和多聚體，中間體阻礙作用大的使蛋白質正確折疊困難，復性就困難；阻礙小或無阻礙的容易復性。降低蛋白濃度可以減少中間體形成提高復性率。減少中間體的形成，可選用添加小分子物質，又叫分子伴侶，如精氨酸、甘油、PEG等小分子物質幫助蛋白質正確折疊。避免多聚體的形成可以加入氧化還原劑（DTT、ß－ME、還原型谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽、Cu2＋等），幫助蛋白質復性中二硫鍵的正確配對，減少錯配率。
復性緩沖液的pH要遠離等電點，離子強度不易過高，10－50mmol/L，離子強度太高蛋白質易發生沉澱，也不利於離子交換層析的分離；復性液溫度不易過高在4℃－10℃較合適對於耐熱蛋白也可以室溫復性。復性時間，以天然表達的重組蛋白復性應在6hr以上，需要進行酶切的融和表達重組蛋白，至少要復性1hr以上，方可進行進一步的酶切。
復性方式：常用的有透析復性和稀釋復性。透析復性適用於小樣品制備；對於大樣品制備，採用稀釋復性法簡便、實用。一般包含體蛋白的復性濃度不易過大，不同的蛋白質有所區別，一般掌握在100－200ug/ml較合適，蛋白濃度太稀使純化流程過長，蛋白濃度太濃，蛋白質復性不完全，會直接影響蛋白的回收率。直接稀釋有困難的，也可以試用分段稀釋法。
蛋白質的復性是重組蛋白純化中最關鍵和最復雜的問題。蛋白質的性質不同，所處的環境不同，使其復性條件大不相同。任何一個蛋白質都有一個最佳的復性條件，這個最佳條件的選擇是靠大量的實驗來完成的。只有選擇到了合適的復性緩沖液，使蛋白得以正確折疊，才能使進一步的層析分離得以順利完成。
② 蛋白透析復性後，調pH變渾濁，蛋白會有影響嗎
問錯地方了。這么專業的生物知識，最好去搜索文獻。關於包涵體的文獻太多了。基本上做蛋白的都有涉及。 不要在這問，自己多一些文獻，比這里的回答強的多。
簡單找了點。
對於尿素和鹽酸胍該怎麼選擇?
尿素和鹽酸胍屬中強度變性劑，易經透析和超濾除去。它們對包涵體氫鍵有較強的可逆性變性作用，所需濃度尿素8-10M，鹽酸胍6-8M。尿素溶解包涵體較鹽酸胍慢而弱，溶解度為70-90%，尿素在作用時間較長或溫度較高時會裂解形成氰酸鹽，對重組蛋白質的氨基進行共價修飾，但用尿素溶解具有不電離，呈中性，成本低，蛋白質復性後除去不會造成大量蛋白質沉澱以及溶解的包涵體可選用多種色譜法純化等優點，故目前已被廣泛採用。
鹽酸胍溶解能力達95%以上，且溶解作用快而不造成重組蛋白質的共價修飾。但它也有成本高、在酸性條件下易產生沉澱、復性後除去可能造成大量蛋白質沉澱和對蛋白質離子交換色譜有干擾等缺點。
2. 怎樣洗滌包涵體？
通常的洗滌方法一般是洗不幹凈的，可以先把包涵體用6M鹽酸胍溶解充分，過濾除去未溶解的物質，注意留樣跑電泳，然後用水稀釋到4M,離心把沉澱和上清分別跑電泳，如此類推可以一直稀釋到合適的濃度，可以找到一個合適去除雜質的辦法，其實這就是梯度沉澱的方法，比通常的直接洗脫效果好。
3. 8M尿素溶解的包涵體溶液應如何保存?
在4度放置半個月，都沒什麼問題 。在室溫放置超過48小時，可能會對目的蛋白有影響，因為尿素在鹼性條件下可使一些氨基酸醯基化，所以早些處理BI溶液比較好。
4. 包涵體復性有什麼原則？
低濃度，平緩梯度，低溫。
5. 復性時的蛋白濃度是？
一般使用濃度為0.1-1mg/ml，太高的濃度容易形成聚體沉澱，太低的濃度不經濟，而且很多蛋白在低濃度時不穩定，很容易變性。
6. 復性中蛋白析出是怎麼回事？該怎麼處理？
出現蛋白析出，肯定是條件變化太劇烈了。復性應該採取復性液濃度和PH值逐漸變化的方法，例如根據包涵體的溶液成分，每隔1個PH或濃度值配置一種溶液，逐步透析到正常。此外透析時必須濃度極低，條件溫和，使蛋白質能夠正確折疊。但是復性的比率應該很低。
若加變性劑尿素可加到2M，鹽酸胍可加到1-1.5M；
另外可將甘油濃度增加，范圍可在≤30%，且在復性樣品中也可加適量甘油。
③ 求助離子交換柱純化蛋白的問題
離子交換樹脂是一類具有離子交換功能的高分子材料。在溶液中它能將本身的離子與溶液中的同號離子進行交換。按交換基團性質的不同，離子交換樹脂可分為陽離子交換樹脂和陰離子交換樹脂兩類。
陽離子交換樹脂大都含有磺酸基（—SO3H）、羧基（—COOH）或苯酚基（—C6H4OH）等酸性基團，其中的氫離子能與溶液中的金屬離子或其他陽離子進行交換。例如苯乙烯和二乙烯苯的高聚物經磺化處理得到強酸性陽離子交換樹脂，其結構式可簡單表示為R—SO3H，式中R代表樹脂母體，其交換原理為
2R—SO3H＋Ca2＋ （R—SO3）2Ca＋2H+
這也是硬水軟化的原理。
陰離子交換樹脂含有季胺基[-N（CH3）3OH]、胺基（—NH2）或亞胺基（—NH2）等鹼性基團。它們在水中能生成OH-離子，可與各種陰離子起交換作用，其交換原理為
R—N（CH3）3OH＋Cl- R—N（CH3）3Cl＋OH-
由於離子交換作用是可逆的，因此用過的離子交換樹脂一般用適當濃度的無機酸或鹼進行洗滌，可恢復到原狀態而重復使用，這一過程稱為再生。陽離子交換樹脂可用稀鹽酸、稀硫酸等溶液淋洗；陰離子交換樹脂可用氫氧化鈉等溶液處理，進行再生。
離子交換樹脂的用途很廣，主要用於分離和提純。例如用於硬水軟化和製取去離子水、回收工業廢水中的金屬、分離稀有金屬和貴金屬、分離和提純抗生素等。
④ 蛋白質復性的機理是什麼。臨床應用有哪些
所謂復性是指恢復活性。
即很多蛋白質在表達和合成的過程中，從一級結構是氨基酸鏈折疊為二，三，四級立體結構時，由於折疊速度，IPTG誘導劑的量和蛋白質動力學影響因素等等不同原因有可能造成蛋白質錯誤折疊或形成不溶解的包涵體，使本來有活性的蛋白質失去活性。復性一般首先採用變性劑把蛋白質打開成為氨基酸鏈，繼而在溫和的環境下經過稀釋和透析等使蛋白質重新折疊，由於蛋白質動力學的影響，蛋白質會自認折疊為這種蛋白質固有的結構，從而重新折疊成有活性的蛋白質。這是復性的實際意義。
⑤ 復性劑的存放時間對蛋白質復性的影響
蛋白質的復性 蛋白質復性的最大問題，是在復性過程中形成中間體和多聚體，中間體阻礙作用大的使蛋白質正確折疊困難，復性就困難；阻礙小或無阻礙的容易復性。降低蛋白濃度可以減少中間體形成提高復性率。減少中間體的形成，可選用添加小分子物質，又叫分子伴侶，如精氨酸、甘油、PEG等小分子物質幫助蛋白質正確折疊。避免多聚體的形成入氧化還原劑（DTT、szlig;－ME、還原型谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽、Cu2＋等），幫助蛋白質復性中二硫鍵的正確配對，減少錯配率。復性緩沖液的pH要遠離等電點，離子強度不易過高，10－50mmol/L，離子強度太高蛋白質易發生沉澱，也不利於離子交換層析的分離；復性液溫度不易過高在4℃－10℃較合適對於耐熱蛋白也可以室溫復性。復性時間，以天然表達的重組蛋白復性應在6hr以上，需要進行酶切的融和表達重組蛋白，至少要復性1hr以上，方可進行進一步的酶切。 復性方式：常用的有透析復性和稀釋復性。透析復性適用於小樣品制備；對於大樣品制備，採用稀釋復性法簡便、實用。一般包含體蛋白的復性濃度不易過大，不同的蛋白質有所區別，一般掌握在100－200ug/ml較合適，蛋白濃度太稀使純化流程過長，蛋白濃度太濃，蛋白質復性不完全，會直接影響蛋白的回收率。直接稀釋有困難的，也可以試用分段稀釋法。蛋白質的復性是重組蛋白純化中最關鍵和最復雜的問題。蛋白質的性質不同，所處的環境不同，使其復性條件大不相同。任何一個蛋白質都有一個最佳的復性條件，這個最佳條件的選擇是靠大量的實驗來完成的。只有選擇到了合適的復性緩沖液，使蛋白得以正確折疊，才能使進一步的層析分離得以順利完成。
⑥ 蛋白質復性的分離步驟
分離包涵體並復性蛋白質的操作步驟並不復雜，從破碎細胞開始，然後將細胞勻漿離心，回收包涵體後，加入變性劑溶解包涵體，使之成為可溶性伸展態，再通過透析等除去變性劑使表達產物折疊恢復天然構象及活性。
但在實際研究中發現，在體外折疊時，蛋白質分子間由於存在大量錯誤折疊和聚合，復性效率往往很低。究其原因，蛋白質的立體結構雖然由其氨基酸順序決定，然而伸展肽鏈折疊為天然活性結構的過程還受到周圍環境的影響。
⑦ 蛋白質復性
問錯地方了。這么專業的生物知識，最好去搜索文獻。關於包涵體的文獻太多了。基本上做蛋白的都有涉及。 不要在這問，自己多下載一些文獻，比這里的回答強的多。
簡單找了點。
1. 對於尿素和鹽酸胍該怎麼選擇?
尿素和鹽酸胍屬中強度變性劑，易經透析和超濾除去。它們對包涵體氫鍵有較強的可逆性變性作用，所需濃度尿素8-10M，鹽酸胍6-8M。尿素溶解包涵體較鹽酸胍慢而弱，溶解度為70-90%，尿素在作用時間較長或溫度較高時會裂解形成氰酸鹽，對重組蛋白質的氨基進行共價修飾，但用尿素溶解具有不電離，呈中性，成本低，蛋白質復性後除去不會造成大量蛋白質沉澱以及溶解的包涵體可選用多種色譜法純化等優點，故目前已被廣泛採用。
鹽酸胍溶解能力達95%以上，且溶解作用快而不造成重組蛋白質的共價修飾。但它也有成本高、在酸性條件下易產生沉澱、復性後除去可能造成大量蛋白質沉澱和對蛋白質離子交換色譜有干擾等缺點。
2. 怎樣洗滌包涵體？
通常的洗滌方法一般是洗不幹凈的，可以先把包涵體用6M鹽酸胍溶解充分，過濾除去未溶解的物質，注意留樣跑電泳，然後用水稀釋到4M,離心把沉澱和上清分別跑電泳，如此類推可以一直稀釋到合適的濃度，可以找到一個合適去除雜質的辦法，其實這就是梯度沉澱的方法，比通常的直接洗脫效果好。
3. 8M尿素溶解的包涵體溶液應如何保存?
在4度放置半個月，都沒什麼問題 。在室溫放置超過48小時，可能會對目的蛋白有影響，因為尿素在鹼性條件下可使一些氨基酸醯基化，所以早些處理BI溶液比較好。
4. 包涵體復性有什麼原則？
低濃度，平緩梯度，低溫。
5. 復性時的蛋白濃度是？
一般使用濃度為0.1-1mg/ml，太高的濃度容易形成聚體沉澱，太低的濃度不經濟，而且很多蛋白在低濃度時不穩定，很容易變性。
6. 復性中蛋白析出是怎麼回事？該怎麼處理？
出現蛋白析出，肯定是條件變化太劇烈了。復性應該採取復性液濃度和PH值逐漸變化的方法，例如根據包涵體的溶液成分，每隔1個PH或濃度值配置一種溶液，逐步透析到正常。此外透析時必須濃度極低，條件溫和，使蛋白質能夠正確折疊。但是復性的比率應該很低。
若加變性劑尿素可加到2M，鹽酸胍可加到1-1.5M；
另外可將甘油濃度增加，范圍可在≤30%，且在復性樣品中也可加適量甘油。
⑧ 蛋白質復性的復性研究
環糊精與直鏈糊精輔助蛋白質復性的研究
1995年，Karuppiah 和Sharma發表文章，介紹了使用環糊精輔助碳酸酐酶B的復性[9]。環糊精由澱粉通過環糊精葡萄糖基轉移酶降解製得，是由D-吡喃葡萄糖單元以α-1，4-糖苷鍵相互結合成互為椅式構象的環狀低聚糖，其分子通常含有6～12個吡喃葡萄糖單元。有實用意義的是含6、7、8個吡喃葡萄糖單元的α、β、γ-環糊精，但α-環糊精空腔較小，γ-環糊精價格昂貴，常用的是β-環糊精[10]。環糊精的特徵是能形成包絡化合物，客體分子從寬口端進入其分子空腔。包絡物的形成主要靠非共價鍵相互作用如范德華力、氫鍵、疏水相互作用、幾何形狀匹配等。利用環糊精的疏水性空腔結合變性蛋白質多肽鏈的疏水性位點，可以抑制其相互聚集失活，從而促進肽鏈正確折疊為活性蛋白質。
1999年，Sundari等報道了用直鏈糊精輔助胰島素、碳酸酐酶和雞蛋白溶菌酶復性[11]，發現直鏈糊精基本上能夠模擬環糊精在輔助蛋白質復性方面的作用，而且具有這樣一些優點：直鏈糊精的螺旋結構形成一個疏水性空管，可以結合更多的蛋白質分子；在水中溶解度較高，有利於提高復性酶濃度和實驗操作；價格比環糊精便宜，實際應用前景更廣闊。