凝膠過濾色譜的原理

⑴ 凝膠層析法為什麼能測出蛋白質的分子量原理是什麼

原理簡單說就是分子量不同通過凝膠柱的速度也不同

凝膠是一種具有多孔,網狀結構的分子篩.利用這種凝膠分子篩對大小,形狀不同的分子進行層析分離,稱凝膠層析 .
凝膠層析的應用范圍:
凝膠層析法適用於分離和提純蛋白質,酶,多肽,激素,多糖,核酸類等物質.分子大小彼此相差25%的樣品,只要通過單一凝膠床就可以完全將它們分開.利用凝膠的分子篩特性,可對這些物質的溶液進行脫鹽,濃縮,去熱源和脫色.
凝膠層析的優點
凝膠層析具有設備簡單,操作方便,分離迅速及不影響分子生物學活性等優點.目前已被廣泛應用於各種生化產品的分離和純化.
-,凝膠層析的基本原理
凝膠層析的原理
l 分子大小不同混合物上柱; 2 洗脫開始,小分子擴散進人凝膠顆粒內,大分子被排阻於顆粒之外;3 大小分子分開: 4大分子行程較短,已洗脫出層析柱,小分子尚在進行中
凝膠是一類多孔性高分子聚合物,每個顆粒猶如一個篩子.當樣品溶液通過凝膠柱時,相對分子質量較大的物質由於直徑大於凝膠網孔而只能沿著凝膠顆粒間的孔隙,隨著溶劑流動,因此流程較短,向前移動速度快而首先流出層析柱;反之,相對分子質量較小的物質由於直徑小於凝膠網孔,可自由地進出凝膠顆粒的網孔,在向下移動過程中,它們從凝膠內擴散到膠粒孔隙後再進入另一凝膠顆粒,如此不斷地進入與逸出,使流量增長,移動速率慢而最後流出層析柱.而中等大小的分子,它們也能在凝膠顆粒內外分布,部分進入顆粒,從而在大分子物質與小分子物質之間被洗脫.這樣,經過層析柱,使混合物中的各物質按其分子大小不同而被分離.

⑵ 凝膠色譜法原理為什麼是根據蛋白質相對分子質量大小而不是分子大小。有什麼區別

凝膠滲透色譜(Gel Permeation Chromatography、GPC))
1964年，由J.C.Moore首先研究成功。不僅可用於小分子物質的分離和鑒定，而且可以用來分析化學性質相同分子體積不同的高分子同系物。(聚合物在分離柱上按分子流體力學體積大小被分離開）
1.基本原理

1.1分離原理
讓被測量的高聚物溶液通過一根內裝不同孔徑的色譜柱，柱中可供分子通行的路徑有粒子間的間隙（較大）和粒子內的通孔（較小）。當聚合物溶液流經色譜柱時，較大的分子被排除在粒子的小孔之外，只能從粒子間的間隙通過，速率較快；而較小的分子可以進入粒子中的小孔，通過的速率要慢得多。經過一定長度的色譜柱，分子根據相對分子質量被分開，相對分子質量大的在前面（即淋洗時間短），相對分子質量小的在後面（即淋洗時間長）。自試樣進柱到被淋洗出來，所接受到的淋出液總體積稱為該試樣的淋出體積。 當儀器和實驗條件確定後，溶質的淋出體積與其分子量有關，分子量愈大，其淋出體積愈小。
（1） 體積排除
（2）限性擴散
（3） 流動分離
1.2校正原理
用已知相對分子質量的單分散標准聚合物預先做一條淋洗體積或淋洗時間和相對分子質量對應關系曲線，該線稱為「校正曲線」。聚合物中幾乎找不到單分散的標准樣，一般用窄分布的試樣代替。在相同的測試條件下，做一系列的GPC標准譜圖，對應不同相對分子質量樣品的保留時間，以lgM對t作圖，所得曲線即為「校正曲線」。通過校正曲線，就能從GPC譜圖上計算各種所需相對分子質量與相對分子質量分布的信息。聚合物中能夠製得標准樣的聚合物種類並不多，沒有標准樣的聚合物就不可能有校正曲線，使用GPC方法也不可能得到聚合物的相對分子質量和相對分子質量分布。對於這種可以使用普適校正原理。
1.3普適校正原理
由於GPC對聚合物的分離是基於分子流體力學體積，即對於相同的分子流體力學體積，在同一個保留時間流出，即流體力學體積相同。
兩種柔性鏈的流體力學體積相同：
[η]1M1=[η]2M2
k1M1α1+1=k1M2α2+1
兩邊取對數：lgk1+(α1+1)lgM1=lgk2+(α2+1)lgM2
即如果已知標准樣和被測高聚物的k、α值，就可以由已知相對分子質量的標准樣品M1標定待測樣品的相對分子質量M2。
[編輯本段]2.實驗部分
直接法：在測定淋出液濃度的同時測定其粘度或光散射，從而求出其分子量。
間接法：用一組分子量不等的、單分散的試樣為標准樣品，分別測定它們的淋出體積和分子量，則可確定二者之間的關系。
2.1.儀器：
GPC儀的組成：泵系統、（自動）進樣系統、凝膠色譜柱、檢測系統和數據採集與處理系統。
2.1.1.泵系統：包括一個溶劑儲存器、一套脫氣裝置和一個高壓泵。它的工作是使流動相（溶劑）以恆定的流速流入色譜柱。泵的工作狀況好壞直接影響著最終數據的准確性。越是精密的儀器，要求泵的工作狀態越穩定。要求流量的誤差應該低於0.01mL/min。
2.1.2.色譜柱：GPC儀分離的核心部件。是在一根不銹鋼空心細管中加入孔徑不同的微粒作為填料。每根色譜柱都有一定的相對分子質量分離范圍和滲透極限，色譜柱有使用的上限和下限。色譜柱的使用上限是當聚合物最小的分子的尺寸比色譜柱中最大的凝膠的尺寸還大，這時高聚物進入不了凝膠顆粒孔徑，全部從凝膠顆粒外部流過，這就沒有達到分離不同相對分子質量的高聚物的目的。而且還有堵塞凝膠孔的可能，影響色譜柱的分離效果，降低其使用壽命。色譜柱的使用下限就是當聚合物中最大尺寸的分子鏈比凝膠孔的最小孔徑還要小，這時也沒有達到分離不同相對分子質量的目的。所以在使用凝膠色譜儀測定相對分子質量時，必須首先選擇好與聚合物相對分子質量范圍相配的色譜柱。
2.1.3.填料（根據所使用的溶劑選擇填料，對填料最基本的要求是填料不能被溶劑溶解）：交聯聚苯乙烯凝膠（適用於有機溶劑，可耐高溫）、交聯聚乙酸乙烯酯凝膠（最高100℃，適用於乙醇、丙酮一類極性溶劑）多孔硅球（適用於水和有機溶劑）、多孔玻璃、多孔氧化鋁（適用於水和有機溶劑)
2.1.4.柱子：玻璃、不銹鋼
2.1.5.檢測系統：通用型檢測器：適用於所有高聚物和有機化合物的檢測。有示差折光儀檢測器、紫外吸收檢測器、粘度檢測器。
2.1.6.示差折光儀檢測器：溶劑的折光指數與被測樣品的折光指數有盡可能大的區別。
2.1.7.紫外吸收檢測器：在溶質的特徵吸波長附近溶劑沒有強烈的吸收。
2.1.8.選擇型檢測器：適用於對該檢測器有特殊響應的高聚物和有機化合物。有紫外、紅外、熒光、電導檢測器等。
2.2.操作：
2.2.1.溶劑的選擇： 能溶解多種聚合物；不能腐蝕儀器部件；與檢測器相匹配。
2.2.2.把激光光散射與凝膠色譜儀聯用，在得到濃度譜圖的同時，還可得到散射光強對淋出體積的譜圖，從而計算出分子量分布曲線和整個試樣的各種平均分子量
2.2.3.激光光散射實驗中必須對樣品嚴格除塵，溶液中的灰塵會產生強烈的光散射，嚴重干擾聚合物溶液光散射的測量。溶液除塵是光散射成敗的關鍵。首先是溶劑除塵，配置測試樣品的溶劑應進行精餾，並經過0.2μm超濾膜過濾後方可使用。配好的溶液也要用0.2μm的超濾膜過濾。另外，測試中所用的器械，如：注射器等，使用前要用洗液浸泡，清水強力沖洗。

⑶ 凝膠過濾層析和離子交換層析分離蛋白質的原理有何不同

所有的層析在原理上都是相通的,區別在於流動相和層析劑之間的作用力的不同.
離子內交換是利容用蛋白質表面的電荷與層析劑上的離子基團的靜電作用.
凝膠過濾層析利用了凝膠的多孔性,根據溶劑分子的大小進行分離.

⑷ 大孔樹脂吸附技術和凝膠過濾色譜的區別

凝膠過濾色譜法：解析度較高，但是上樣量僅為柱體積的1%，而且對流速也有嚴內格的限制。容離子交換色譜法：根據目的蛋白質表面所含有的氨基酸殘基帶有的凈電荷分離蛋白質，但是解析度沒有凝膠過濾高。親和層析法：根據生物分子的特異性分離目的蛋白，特異性很高，但是配件容易丟失適合含有特異性的標簽的或者抗體。疏水色譜：根據疏水性來分離蛋白質,缺點是有的蛋白質在高鹽中溶解度降低，所以應用范圍受到限制，適合蛋白質表面含有較多疏水性氨基酸殘基的疏水性蛋白質。

⑸ 凝膠層析的分離原理是什麼

凝膠色譜又叫排阻色譜，用的是葡聚糖凝膠的孔徑大小不一，來對大分子化合物進行分類。分子大的，不能通過凝膠的內部孔的，最先流出，分子小的，可以進入孔中的，會被凝膠保留，會較晚流出。具體原理在色譜理論裡面有詳細的介紹。如有不明之處，請追問！

⑹ 分離純化常用的色譜分離方法有哪些它們的原理是什麼

1、色譜方法根據分離機制的不同可分為吸附色譜、分配色譜、離子交專換色譜、凝膠過屬濾（分子篩）色譜和親和色譜等。2、（1）吸附色譜法是指混合物隨流動相通過吸附劑時，由於該吸附劑對不同物質有不同的吸附力而使混合物分離的方法。（2）分配色譜系法是利用固定相與流動相之間對待分離組分溶解度的差異來實現分離。（3）離子交換色譜法是利用離子交換原理和液相色譜技術的結合來測定溶液中陽離子和陰離子的一種分離分析方法。凡在溶液中能夠電離的物質通常都可以用離子交換色譜法進行分離。（4）凝膠色譜法又叫凝膠色譜技術，是六十年代初發展起來的一種快速而又簡單的分離分析技術，由於設備簡單、操作方便，不需要有機溶劑，對高分子物質有很高的分離效果。（5）親和色譜法是將相互間具有高度特異親和性的二種物質之一作為固定相，利用與固定相不同程度的親和性，使成分與雜質分離的色譜法。

⑺ 凝膠色譜法的原理

凝膠色譜技術是六十年代初發展起來的一種快速而又簡單的分離分析技術，由於設備簡單、操作方便，不需要有機溶劑，對高分子物質有很高的分離效果。凝膠色譜法又稱分子排阻色譜法。凝膠色譜主要用於高聚物的相對分子質量分級分析以及相對分子質量分布測試。目前已經被生物化學、分子生物學、生物工程學、分子免疫學以及醫學等有關領域廣泛採用，不但應用於科學實驗研究，而且已經大規模地用於工業生產。 根據分離的對象是水溶性的化合物還是有機溶劑可溶物，凝膠色譜又可分為凝膠過濾色譜（GFC）和凝膠滲透色譜（GPC）。 分離原理： 一個含有各種分子的樣品溶液緩慢地流經凝膠色譜柱時，各分子在柱內同時進行著兩種不同的運動：垂直向下的移動和無定向的擴散運動。大分子物質由於直徑較大，不易進入凝膠顆粒的微孔，而只能分布顆粒之間，所以在洗脫時向下移動的速度較快。小分子物質除了可在凝膠顆粒間隙中擴散外，還可以進入凝膠顆粒的微孔中，即進入凝膠相內，在向下移動的過程中，從一個凝膠內擴散到顆粒間隙後再進入另一凝膠顆粒，如此不斷地進入和擴散，小分子物質的下移速度落後於大分子物質，從而使樣品中分子大的先流出色譜柱，中等分子的後流出，分子最小的最後流出，這種現象叫分子篩效應。具有多孔的凝膠就是分子篩。 各種分子篩的孔隙大小分布有一定范圍，有最大極限和最小極限。分子直徑比凝膠最大孔隙直徑大的，就會全部被排阻在凝膠顆粒之外，這種情況叫全排阻。兩種全排阻的分子即使大小不同，也不能有分離效果。直徑比凝膠最小孔直徑小的分子能進入凝膠的全部孔隙。如果兩種分子都能全部進入凝膠孔隙，即使它們的大小有差別，也不會有好的分離效果。因此，一定的分子篩有它一定的使用范圍。 一是分子很小，能進入分子篩全部的內孔隙；二是分子很大，完全不能進入凝膠的任何內孔隙；三是分子大小適中，能進入凝膠的內孔隙中孔徑大小相應的部分。大、中、小三類分子彼此間較易分開，但每種凝膠分離范圍之外的分子，在不改變凝膠種類的情況下是很難分離的。對於分子大小不同，但同屬於凝膠分離范圍內各種分子，在凝膠床中的分布情況是不同的：分子較大的只能進入孔徑較大的那一部分凝膠孔隙內，而分子較小的可進入較多的凝膠顆粒內，這樣分子較大的在凝膠床內移動距離較短，分子較小的移動距離較長。於是分子較大的先通過凝膠床而分子較小的後通過凝膠床，這樣就利用分子篩可將分子量不同的物質分離。另外，凝膠本身具有三維網狀結構，大的分子在通過這種網狀結構上的孔隙時阻力較大，小分子通過時阻力較小。分子量大小不同的多種成份在通過凝膠床時，按照分子量大小排隊，凝膠表現分子篩效應。

⑻ 凝膠過濾層析和離子交換層析分離蛋白質的原理有何不同

所有的層析在原理上都是相通的，區別在於流動相和層析劑之間的作用力的不同。
離子交換是利用蛋白質表面的電荷與層析劑上的離子基團的靜電作用。
凝膠過濾層析利用了凝膠的多孔性，根據溶劑分子的大小進行分離。

⑼ 凝膠過濾色譜測分子量的依據是什麼

這個實際上就是凝膠色譜的基本原理。建議你上「色譜世界」網站問問看吧。非常專業的一個色譜網站，會對你有很大幫助的。

⑽ 凝膠色譜法分離蛋白質原理

凝膠色譜法分離蛋白質原理：
大分子物質由於直徑較大，不易進入凝膠顆粒回的微孔，而只能答分布顆粒之間，所以在洗脫時向下移動的速度較快。小分子物質除了可在凝膠顆粒間隙中擴散外，還可以進入凝膠顆粒的微孔中，即進入凝膠相內，在向下移動的過程中，從一個凝膠內擴散到顆粒間隙後再進入另一凝膠顆粒，如此不斷地進入和擴散，小分子物質的下移速度落後於大分子物質，從而使樣品中分子大的先流出色譜柱，中等分子的後流出，分子最小的最後流出 。