離子交換層析法純化抗體
Ⅰ 離子交換層析法分離純化蛋白質有哪些局限性
光用一種分離方法想分出純品是不可能的，離子交換的話得摸清你分離過程蛋白是否易變性。 分離出來稀釋倍數也很大。
Ⅱ 離子交換層析和親和層析相比較哪個對蛋白(抗體)收率高
親和
Ⅲ 離子交換層析和親和層析都可以用來分離所有的蛋白質嗎哪種的效果更好
這個你問的太籠統了，方法沒有最好的，只有最合適的
蛋白的分離純化無非是內利用目標蛋白和容別的蛋白不同進行分離，這包括分子量大小，電荷，極性等特性的不同，此外包括別的特性，特別是酶例如酶需要輔酶象蘋果酸 脫氫酶，或者底物，酶抑制劑，金屬離子等，那相對應的純化方法有凝膠過濾，離子交換，疏水層析，後面的可以分別把底物，酶抑制劑，金屬離子偶聯或鰲合到介質上做親和介質，而象果酸脫氫酶也可以用染料親和的辦法，因為染料的結構和NAD類似。糖蛋白可以用凝集素親和或者苯硼酸瓊脂糖親和分離等方法，總之要盡 量多知道目標蛋白的特性和了解各種分離的手段，就很容易找到最有效的分離純化的方法。
Ⅳ 離子交換層析法分離純化蛋白質有哪些局限性
因為離子交換吸附蛋白質並不是特異性吸附，在某些情況下可能難以判斷結合的蛋版白質權是否為當初設計的目的蛋白。
離子交換吸附依賴於蛋白質表面的靜電荷，如果蛋白質結構比較特殊，可能會有在各種pH都難以結合上離子交換層析的情況。
離子交換層析對於等電點與目標蛋白接近的雜蛋白並沒有很好的分離效果。
Ⅳ 從腹水中純化的抗體不溶解怎麼辦
分別採用辛酸硫酸銨法(CAAS)、硫酸銨沉澱法(AS)和DEAE離子交換層析法對小鼠IgG腹水進行了純化效果的比較.結果表明: CAAS法提取IgG的純度為67-5﹪,高於AS法(43-2﹪),低於DEAE法(100﹪);CAAS法提取IgG的回收率為51-2﹪,遠高於DEAE(8-9﹪),略低於AS法(63-8﹪).將不同純化方法獲得的IgG定容至相同濃度.ELISA試驗結果表明EAE法的OD值明顯降低,表明DEAE純化方法降低了IgG的免疫學活性.說明CAAS法是一種操作簡單、成本低、純化效果和回收效果較佳的提取小鼠腹水IgG的首選方法.
陰離子交換層析法純化gp130單克隆抗體B-S12
Ⅵ 單克隆抗體的純化技術操作步驟
從培養液或腹腔積液獲得的單克隆抗體，不需要純化即可應用於日常診斷或定性研究。如果用於免疫標記測定，須分離和純化。可用半飽和、飽和硫酸銨進行沉澱，進行初步濃縮和純化；可用親和層析法進一步純化。
一、腹水型單抗的純化
在單抗純化之前，一般均需對腹水進行預處理，目的是為了進一步除去細胞及其殘渣、小顆粒物質、以及脂肪滴等。常用的方法有二氧化硅吸附法和過濾離心法，以前者處理效果為佳，而且操作簡便。
1、二氧化硅吸附法
新鮮採集的腹水（或凍存的腹水），2000r/min 15分鍾，除去細胞成分（或凍存過程中形成的固體物質）等；取上層清亮的腹水，等量加入PH7.2巴比妥緩沖鹽水（VBS；0.004mol/L巴比妥，0.15mol/L NaCl，0.8mmol/L Mg2+，0.3mmol/L Ca2+）稀釋；然後以每10ml稀釋腹水中加150mg二氧化硅粉末，混勻，懸液在室溫孵育30分鍾，不時搖動；2000g離心20分鍾，脂質等通過該法除去，即可得澄清的腹水。
2、過濾離心法
用微孔濾膜過濾腹水，以除去較大的凝塊及脂肪滴；用10000g 15分鍾高速離心（4℃）除去細胞殘渣及小顆粒物質。
3、混合法
即上述兩法的組合，先將腹水高速離心，取上清液再用二氧化硅吸附處理。
二、單抗的粗提
1、硫酸銨沉澱法
（1）飽和硫酸銨溶液的配製
500g硫酸銨加入500ml蒸餾水中，加熱至完全溶解，室溫過夜，析出的結晶任其留在瓶中。臨用前取所需的量，用2mol/L NaOH調PH至7.8。
（2）鹽析
吸取10ml處理好的腹水移入小燒杯中，在攪拌下，滴加飽和硫酸銨溶液5.0ml；繼續緩慢攪拌30分鍾；10000r/min離心15分鍾；棄去上清液，沉澱物用1/3飽和度硫酸銨懸浮，攪拌作用30分鍾，同法離心；重復前一步1-2次；沉澱物溶於1.5ml PBS（0.01mol/L PH7.2）或Tris-HCl緩沖液中。
（3）脫鹽
常用柱層析或透析法。柱層析法是將鹽析樣品過Sephadex G-50層析柱，以PBS或Tris-HCl緩沖液作為平衡液和洗脫液，流速每分鍾1ml。第一個蛋白峰即為脫鹽的抗體溶液。透析法是將透析袋於2% NaHCO3，1mmol/L EDTA溶液中煮10分鍾，用蒸餾水清洗透析袋內外表面，再用蒸餾水煮透析袋10分鍾，冷至室溫即可使用（並可於0.2mol/L EDTA溶液中，4℃保存備用）。將鹽析樣品裝入透析袋中，對50-100倍體積的PBS或Tris-HCl緩沖液透析（4℃）12-24小時，其間更換5次透析液，用萘氏試劑（碘化汞11.5g，碘化鉀8g，加蒸餾水50ml，待溶解後，再加20% NaOH 50ml）檢測，直至透析外液無黃色物形成為止。
（4）蛋白質含量的測定
（Pr）（mg/ml）=（1.45×OD280-0.74×OD260）×稀釋倍數；或（Pr）=OD280×稀釋倍數/1.3
（5）分裝凍存備用
2、辛酸-硫酸銨沉澱法
該法簡單易行，適合於提純IgG1和IgG2b，但對IgG3和IgA的回收率及純化效果差。其主要步驟如下：取1份預處理過的腹水加2份0.06mol/L PH5.0醋酸緩沖液，用1mol/L HCl調PH至4.8；按每毫升稀釋腹水加11ul辛酸的比例，室溫攪拌下逐滴加入辛酸，於30分鍾內加完，4℃靜置2小時，取出15000g離心30分鍾，棄沉澱；上清經尼龍篩過濾（125um），加入1/10體積的0.01mol/L PBS，用1mol/L NaOH調PH至7.2；在4℃下加入飽和硫酸銨至45%飽和度，作用30分鍾，靜置1小時；10000g離心30分鍾，棄上清；沉澱溶於適量PBS（含137mmol/L NaCl，2.6mol/L KCl，0.2mmol/L EDTA）中，對50-100倍體積的PBS透析，4℃過夜，其間換水3次以上；取出10000g離心30分鍾，除去不溶性沉渣，測定蛋白質含量後，分裝，凍存備用。
3、優球蛋白沉澱法
該法適用於IgG3和IgM型單抗的提取，所獲製品的抗體活性幾乎保持不變，對IgG3單抗的回收率高於90%，對IgM單抗的回收率為40-90%不等。其操作步驟如下：取一定量的預處理過的腹水，先後加入NaCl和CaCl2，使各自的濃度分別達0.2mol/L和25mmol/L，隨之可見纖維蛋白的產生；經濾紙過濾後，濾液對100倍體積的去離子水透析，4℃ 8-15小時（若是IgG3單抗，也可室溫2小時），其間換水1-2次；取出後22000g離心30分鍾，棄上清；將沉澱溶於PH8.0 1mol/L NaCl，0.1mol/L Tris-HCl溶液中，重復上述的透析與離心；將沉澱的優球蛋白濃度調至5-10mg/ml，分裝凍存備用。
三、單抗純化的方法
單抗純化的方法有很多種，應根據具體單抗的特性和實驗條件選擇適宜的方法，常用的技術有DEAE離子交換層析柱、凝膠過濾法和親和層析法三種。
1、離子交換層析：
分離蛋白質是根據在一定pH 條件下，蛋白質所帶電荷不同而進行的分離方法。常用於蛋白質分離的離子交換劑有弱酸型的羧甲基纖維素(CM纖維素) 和弱鹼型的二乙基氨基乙基纖維素(DEAE纖維素)。前者為陽離子交換劑，後者為陰離子交換劑。
離子交換層析中，基質是由帶有電荷的樹脂或纖維素組成。帶有正電荷的稱之陰離子交換樹脂；而帶有負電荷的稱之陽離子樹脂。離子交換層析同樣可以用於蛋白質的分離純化。由於蛋白質也有等電點，當蛋白質處於不同的pH條件下，其帶電狀況也不同。陰離子交換基質結合帶有負電荷的蛋白質，所以這類蛋白質被留在柱子上，然後通過提高洗脫液中的鹽濃度等措施，將吸附在柱子上的蛋白質洗脫下來。結合較弱的蛋白質首先被洗脫下來。反之陽離子交換基質結合帶有正電荷的蛋白質，結合的蛋白可以通過逐步增加洗脫液中的鹽濃度或是提高洗脫液的pH值洗脫下來
2、凝膠過濾法：
一定型號的凝膠網孔大小一定，只允許相應大小的分子進入凝膠顆粒內部，大分子則被排阻在外。洗脫時，大分子隨洗脫液從顆粒間隙流下來，洗脫液體積小，小分子則在顆粒網狀結構中穿來穿去，歷程長，後洗脫下來，洗脫體積大。
缺點：從凝膠過濾的原理可知，蛋白質分子通過凝膠柱的速度(即洗脫體積的大小)並不直接取決於分子的質量，而是它的斯篤克半徑，利用凝膠過濾法測定蛋白質分子量時，標准蛋白質(已知分子量和斯篤克半徑)和待測蛋白質必須具有相同的分子形狀(接近球體)，否則不能得到比較准確的分子量。分子形狀為線形的或與凝膠能發生吸附作用的蛋白質，則不能用此方法測定分子量。而且柱子成本比較高，整個實驗過程耗時很長。
3、免疫親和層析法：
是利用生物體內存在的抗原、抗體之間高度特異性的親和力進行分離的方法。親和層析的應用主要是生物大分子的分離、純化。利用抗原、抗體之間高特異的親和力而進行分離的方法又稱為免疫親和層析。例如將抗原結合於親和層析基質上，就可以從血清中分離其對應的抗體。在蛋白質工程菌發酵液中所需蛋白質的濃度通常較低。
用離子交換、凝膠過濾等方法都難於進行分離，而親和層析法則是一種非常有效的方法。將所需蛋白質作為抗原，經動物免疫後制備抗體，將抗體與適當基質偶聯形成親和吸附劑，就可以對發酵液中的所需蛋白質進行分離純化。
Ⅶ 離子交換層析法分離純化蛋白質有哪些局限性
1，離子交換樹脂固定床的床層壓力會隨著分離過程的進程而不斷加大，需要重新填充回。同時答，也造成固定床填充過程操作麻煩，而且密封性要求高。2，蛋白質分離純度問題，如果在出峰之後再行切換接收餾分，而在峰行下降後提前切換，雖可以保證純度，但蛋白分離收率則會下降。3，由於交換層析介質決定，不同蛋白質相互分離效果也不確定，這種分離，也易造成各蛋白峰重疊，造成分離純度下降。4，自動化程度不高。主要也是受固定床以及樹脂交換飽和當量無法保持長期穩定造成的。無法像液相色譜柱那樣，可以在標樣標定後，建立方法，自動分離目標蛋白。5，不過，規模化分離純化蛋白質過程，使用這種層析法，還是具有一定優勢的。
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詳細資料請參考：
離子交換層析: http://proct.bio1000.com/100474/
Ⅷ 如何將多克隆抗體進行分離純化
多克隆抗體的提取純化
一、批量提取法
稱取DEAE-纖維素(DE32或DE52)50g，置於1000ml燒杯中，先以蒸餾水漂浮除去細顆粒，再經酸鹼處理後，用0.01～0.05mol/L，pH8.0左右的磷酸鹽緩沖液(PB)平衡。將水分抽干，或用布氏濾斗(內放兩層濾紙)過濾，收集濕纖維素，以降低其離子強度。按1ml血清加濕重5g DEAE纖維素，經過充分攪拌，置4℃吸附1h。上清液可再如此處理一次，即獲得較純的IgG。該法提取IgG簡便，既可小量提取，也可大量制備。
二、Tris-Cl離子交換層析法(Ion-exchange chromatography)
材料和試劑
1. DE32或DE52纖維素。
2. HCl；NaOH；0.01～0.05mol/L，pH8.0 PB；0.01mol/L，pH8.6 Tris-Cl；0.5mol/L NaCl。
3. 待純化標本：雜交瘤腹水或培養上清，免疫血清或飽和硫酸銨粗提品。
4. 1.5×50cm 層析柱；透析袋；紫外分光光度計及其他透析和層析所需的試劑和器材。
操作步驟
1.DE52纖維素的處理：DE52經酸、鹼處理，0.01mol/L，pH8.6 Tris-Cl平衡。
2. 裝柱：將層析柱固定於滴定架上，柱底墊一圓形尼龍紗，出口接一細塑料管並關閉出水。將浸泡於0.01mol/L，pH8.6 Tris-Cl中的DE52沿玻璃棒倒入柱中，待DE52自然沉降3～5cm高時，吸除0.01mol/L，pH8.6 Tris-Cl，或松開出水口螺旋夾，控制流速1～2ml/min，同時連續加入DE52至所需高度。待DE52完全沉降後，柱面放一圓形濾紙片。
3. 平衡：松開出水口螺旋夾，以0.01mol/L，pH8.6 Tris-Cl平衡，控制流速為15滴/min，待流出液與洗脫液之pH值達到一致時，停止平衡。
4. 待提取樣品的准備：將蛋白裝入透析袋裡，置4℃冰箱，對0.01mol/L pH8.6 Tris-Cl透析過夜。
5. 加樣、洗脫與收集：用吸管吸去柱面液體，以毛細吸管沿柱壁加入樣品，樣品體積相當於柱床體積的1％～2％，蛋白濃度為50～70mg。啟開出水口螺旋夾使樣品緩慢進入柱床內，並用少量洗脫液清洗柱壁；待液體進入柱床後，以0.01mol/L，pH8.6 Tris-Cl洗脫，控制流速為14～16滴/min。分部收集器收集，紫外監測，或人工收集，以紫外分光光度計分別測定每管280nm OD值，描繪洗脫液峰。
6. 濃縮：將洗脫液的280nm OD上峰段與下峰段各管分別合並，裝入透析袋，以PEG濃縮至所需體積。
三、Tris-PO4 離子交換層析法
該法在上述方法的基礎上稍加改良，即通過梯度洗脫，可用於血清中IgG和IgM的提取。
材料和試劑
1. DE32或DE52纖維素。
2. 待純化標本：雜交瘤腹水或培養上清，免疫血清或飽和硫酸銨粗提品。
3. 1.5×50cm 層析柱；透析袋及其他透析和層析所需的試劑和器材。
4. 梯度洗脫液包括：0.005 mol/L，pH8.6 Tris-PO4 ；0.055mol/L，pH6.0 Tris-PO4 ；0.5mol/L，pH5.1 Tris-PO4 。
操作步驟
1. 蛋白標本對0.005mol/L，pH8.6 Tris-PO4 透析。
2. DE52裝柱，並以0.005mol/L，pH8.6 Tris-PO4 平衡。
3. 加樣，以0.005mol/L，pH8.6 Tris-PO4 洗脫，紫外監測直至洗脫液280nm OD回到基線。這一步驟可除去血清中其他蛋白。
4. 以350ml 0.055mol/L，pH6.0 Tris-PO4 洗脫，這一步驟可用於純化血清IgG和IgM。
5. 以125ml 0.055mol/L，pH6.0 Tris-PO4 和125ml 0.5mol/L，pH5.1 Tris-PO4 梯度洗脫，總量收集250ml；重復步驟（5）。
6. 根據280nm峰值合並蛋白峰，透析濃縮和保存同上。
用過的DE52可用0.01mol/L，pH8.6 Tris-Cl和0.5mol/L NaCl、0.01mol/L，pH8.6 Tris-Cl梯度洗脫回收。再用蒸餾水洗至中性，加入0.02％疊氮鈉於4℃保存備用。
Ⅸ 離子交換法的純化方法
若將離子交換法與其他純化水質方法(例如反滲透法、過濾法和活性碳吸附法)組合應用版時，則離權子交換法在整個純化系統中，將扮演非常重要的一個部分。離子交換法能有效的去除離子，卻無法有效的去除大部分的有機物或微生物。而微生物可附著在樹脂上，並以樹脂作為培養基，使得微生物可快速生長並產生熱源。因此，需配合其他的純化方法設計使用。