將4種核苷酸吸附於陰離子交換柱上

① 簡述核酸分離的基本 原理

核酸分離與純化的原則
核酸在細胞中總是與各種蛋白質結合在一起的。核酸的分離主要是指將核酸與蛋白質、多糖、脂肪等生物大分子物質分開。在分離核酸時應遵循以下原則:保證核酸分子一級結構的完整性;排除其他分子污染。

核酸分離與純化的步驟
大多數核酸分離與純化的方法一般都包括了細胞裂解、酶處理、核酸與其他生物大分子物質分離、核酸純化等幾個主要步驟。每一步驟又可由多種不同的方法單獨或聯合實現。
1. 細胞裂解:核酸必須從細胞或其他生物物質中釋放出來。細胞裂解可通過機械作用、化學作用、酶作用等方法實現。
(1) 機械作用:包括低滲裂解、超聲裂解、微波裂解、凍融裂解和顆粒破碎等物理裂解方法。這些方法用機械力使細胞破碎,但機械力也可引起核酸鏈的斷裂,因而不適用於高分子量長鏈核酸的分離。有報道超聲裂解法提取的核酸片段長度從< 500bp ～ > 20kb 之間,而顆粒勻漿法提取的核酸一般< 10kb。
(2) 化學作用:在一定的p H 環境和變性條件下,細胞破裂,蛋白質變性沉澱,核酸被釋放到水相。上述變性條件可通過加熱、加入表面活性劑(SDS、Triton X-100 、Tween 20 、NP-40 、CTAB、sar-cosyl 、Chelex-100 等) 或強離子劑(異硫氰酸胍、鹽酸胍、肌酸胍) 而獲得。而p H 環境則由加入的強鹼(NaOH) 或緩沖液 ( TE、STE 等) 提供。在一定的p H 環境下,表面活性劑或強離子劑可使細胞裂解、蛋白質和多糖沉澱,緩沖液中的一些金屬離子螯合劑( EDTA 等) 可螯合對核酸酶活性所必須的金屬離子Mg2+ 、Ca2+ ,從而抑制核酸酶的活性,保護核酸不被降解。
(3) 酶作用:主要是通過加入溶菌酶或蛋白酶(蛋白酶K、植物蛋白酶或鏈酶蛋白酶) 以使細胞破裂,核酸釋放。蛋白酶還能降解與核酸結合的蛋白質,促進核酸的分離。其中溶菌酶能催化細菌細胞壁的蛋白多糖N-乙醯葡糖胺和N-乙醯胞壁酸殘基間的β-(1 ,4) 鍵水解。蛋白酶K能催化水解多種多肽鍵,其在65 ℃及有EDTA、尿素(1～4mol/ L) 和去污劑(0. 5 %SDS 或 1 %Triton X-100) 存在時仍保留酶活性,這有利於提高對高分子量核酸的提取效率。在實際工作中,酶作用、機械作用、化學作用經常聯合使用。具體選擇哪種或哪幾種方法可根據細胞類型、待分離的核酸類型及後續實驗目的來確定。

2. 酶處理:在核酸提取過程中,可通過加入適當的酶使不需要的物質降解,以利於核酸的分離與純化。如在裂解液中加入蛋白酶(蛋白酶K 或鏈酶蛋白酶) 可以降解蛋白質,滅活核酸酶(DNase 和RNase) ,DNase 和RNase 也用於去除不需要的核酸。

3. 核酸的分離與純化:核酸的高電荷磷酸骨架使其比蛋白質、多糖、脂肪等其他生物大分子物質更具親水性,根據它們理化性質的差異,用選擇性沉澱、層析、密度梯度離心等方法可將核酸分離、純化。(1) 酚提取/ 沉澱法:核酸分離的一個經典方法是酚∶氯仿抽提法。細胞裂解後離心分離含核酸的水相,加入等體積的酚∶氯仿∶異戊醇(25 ∶24 ∶1 體積) 混合液。依據應用目的,兩相經漩渦振盪混勻(適用於分離小分子量核酸) 或簡單顛倒混勻(適用於分離高分子量核酸) 後離心分離。疏水性的蛋白質被分配至有機相,核酸則被留於上層水相。酚是一種有機溶劑,預先要用STE 緩沖液飽和,因未飽和的酚會吸收水相而帶走一部分核酸。酚也易氧化發黃,而氧化的酚可引起核酸鏈中磷酸二酯鍵斷裂或使核酸鏈交聯;故在制備酚飽和液時要加入82羥基喹嚀,以防止酚氧化。氯仿可去除脂肪,使更多蛋白質變性,從而提高提取效率。異戊醇則可減少操作過程中產生的氣泡。核酸鹽可被一些有機溶劑沉澱,通過沉澱可濃縮核酸,改變核酸溶解緩沖液的種類以及去除某些雜質分子。典型的例子是在酚、氯仿抽提後用乙醇沉澱,在含核酸的水相中加入p H5. 0～5. 5 ,終濃度為0. 3M 的NaOAc 或KOAc 後,鈉離子會中和核酸磷酸骨架上的負電荷,在酸性環境中促進核酸的疏水復性。然後加入2～2. 5 倍體積的乙醇,經一定時間的孵育,可使核酸有效地沉澱。其他的一些有機溶劑[ 異丙醇、聚乙二醇( PEG) 等]和鹽類(10. 0mol/ L 醋酸銨、8. 0mol/ L 的氯化鋰、氯化鎂和低濃度的氯化鋅等) 也用於核酸的沉澱。不同的離子對一些酶有抑製作用或可影響核酸的沉澱和溶解, 在實際使用時應予以選擇。經離心收集,核酸沉澱用70 %的乙醇漂洗以除去多餘的鹽分,即可獲得純化的核酸。(2) 層析法:層析法是利用不同物質某些理化性質的差異而建立的分離分析方法。包括吸附層析、親和層析、離子交換層析等方法在內的層析法。因分離和純化同步進行,並且有商品試劑盒供應,而被廣泛應用於核酸的純化。在一定的離子環境下,核酸可被選擇性地吸附到硅土、硅膠或玻璃表面而與其他生物分子分離。另外一些選擇性吸附方法以經修飾或包被的磁珠作為固相載體,磁珠可通過磁場分離而無需離心,結合至固相載體的核酸可用低鹽緩沖液或水洗脫。該法分離純化核酸,具有質量好、產量高、成本低、快速、簡便、節省人力以及易於實現自動化等優點。

玻璃粉或玻璃珠被證實為一種有效的核酸吸附劑。在高鹽溶液中,核酸可被吸附至玻璃基質上,離液鹽碘化鈉或高氯酸鈉可促進DNA 與玻璃基質的結合。Dederich 等用酸洗玻璃珠分離純化核酸,獲得高產量的質粒DNA。在該方法中,細胞在鹼性環境下裂解,裂解液用醋酸鉀緩沖液中和後,直接加至含異丙醇的玻璃珠濾板,被異丙醇沉澱的質粒DNA 結合至玻璃珠,用80 %乙醇真空抽洗除去細胞殘片和蛋白質沉澱。最後用含RNase A 的TE 緩沖液洗脫與玻璃珠結合的DNA ,獲得的DNA 可直接用於測序。

Elkin 等使用羧化磁珠分離純化質粒DNA。該法在細胞裂解後,離心分離含質粒的水相,再加入羧化的磁粒,然後用 PEG/ NaCl 沉澱,使目的DNA 吸附至磁珠,最後磁場分離被吸附的DNA ,經乙醇洗滌,用水洗脫,可獲得高產量的適用於毛細管測序的模板DNA。

也有用鐵粒為固相支持物,經磁場分離而純化質粒DNA 的報道。細菌用溶菌酶2煮沸法裂解,質粒被釋放至懸浮液中, 加鐵珠捕獲,用磁場使鐵珠分離,經漂洗後用水洗脫質粒,可獲得高產量、測序級的質粒DNA。
親和層析是利用待分離物質與它們的特異性配體間所具有的特異性親和力來分離物質的一類層析方法。Chandler 等報道了一種用肽核酸(PNA) 分離核酸的方法。PNA 是一類以 N-(2-氨乙基)2甘氨酸結構單元為骨架的DNA 類似物,可作為純化皮克(pg) 級核糖體DNA ( rDNA) 和核糖體RNA ( rRNA) 的試劑。在該方法中,以生物素標記的肽核酸(peptide nucleic acids ,PNAs) 為探針,以包被了抗生蛋白鏈菌素的磁珠作為固相載體。PNA 探針在高鹽環境下, 與目的核酸(DNA 或 RNA) 混合,經煮沸、冰浴、溫育雜交步驟後,直接加入包被了抗生蛋白鏈菌素的順磁性顆粒,經靜置捕獲PNA-核酸雜交體,水洗而獲得純化的核酸。
Schluep 等亦基於親和層析原理,採用一種三螺旋體DNA 的方式進行質粒DNA 的分離。三螺旋體DNA 由同質嘌呤

2 同質嘧啶雙螺旋鏈與同質嘧啶單鏈組成,單鏈上的T 識別A ·T 鹼基,對形成T ·A ·T 三聯體,質子化的單鏈胞嘧啶 (C+ ) 識別G·C 鹼基對形成C ·G·C 三聯體。在適當的條件下,三螺旋體的結合具有高特異性和高穩定性。將配體聚嘧啶寡核苷酸鏈通過化學方法連接至Sephacryl S21000 SF 顆粒上形成親和載體。當含目的序列的質粒DNA 溶液與其混合時,在酸性環境(p H 4. 5～5. 5) 下,質粒結合至親和載體顆粒上,溶液中高濃度的NaCl 可穩定三聯體形式並減少與蛋白質、細胞DNA 的非特異性結合。經一段時間反應後,顆粒懸浮液被加至一層析柱,用適當的洗脫液改變p H 值至鹼性環境,可使三聯體解聚,質粒被洗脫。經該法分離質粒DNA ,質粒產量可達到加入量的62 %。
也有用Schizophyllan ( SPG) 制備親和層析柱分離純化 RNA 的報道。SPG是一種β21 ,32葡聚糖,在低溫下,含RNA 的流動相通過層析柱,Poly (C) 和poly (A) 與SPG通過氫鍵和疏水作用形成復合物而被吸附於柱上,然後通過改變緩沖液成分,將被吸附的RNA 洗脫。親和層析應用於核酸分離與純化的另一個例子是用oligo ( dT)2纖維素層析法從真核細胞總 RNA 中分離帶poly (A) 尾的mRNA。在該方法中,短鏈oligo (dT) 通過其52磷酸與纖維素的羥基共價結合而連接至纖維素介質上。當樣本經過oligo (dT) 柱時,mRNA 因其poly (A) 可與短鏈oligo (dT) 形成穩定的RNA2DNA 雜合鏈,而被連接到纖維素介質上,從而與其他RNA 分離。在適當的條件下(低鹽、加熱) ,poly (A) RNA 可被水洗脫而得以純化。

離子交換層析以具有離子交換性能的物質為固定相,其與流動相中的離子能進行可逆交換,從而能分離離子型化合物。用離子交換層析純化核酸是因為核酸為高負電荷的線性多聚陰離子,在低離子強度緩沖液中,利用目的核酸與陰離子交換柱上功能基質間的靜電反應,使帶負電荷的核酸結合到帶正電的基質上,雜質分子被洗脫。然後提高緩沖液的離子強度,將核酸從基質上洗脫,經異丙醇或乙醇沉澱即可獲得純化的核酸。該法適用於大規模核酸的純化。Ferreira 等用含0. 5 M NaCl 的TE 緩沖液平衡層析柱,加樣後用含1 M NaCl 的TE 緩沖液洗脫核酸,獲得了很好的分離效果。

(3) 密度梯度離心法:密度梯度離心也用於核酸的分離和分析。雙鏈DNA、單鏈DNA、RNA 和蛋白質具有不同的密度,因而可經密度梯度離心形式形成不同密度的純樣品區帶, 該法適用於大量核酸樣本的制備,其中氯化銫2溴化乙錠梯度平衡離心法被認為是純化大量質粒DNA 的首選方法。氯化銫是核酸密度梯度離心的標准介質,梯度液中的溴化乙錠與核酸結合,離心後形成的核酸區帶經紫外燈照射,產生熒光而被檢測,用注射針頭穿刺回收後,通過透析或乙醇沉澱除去氯化銫而獲得純化的核酸。

② p h3.5，四種核苷酸所帶的電荷數是怎麼算的

四種核苷酸所帶的電荷數是怎麼算的
① 電泳分離4種核苷酸時應取pH3.5 的緩沖液，在該pH時，這4種單核苷酸之間所帶負電荷差異較大，它們都向正極移動，但移動的速度不同，依次為：UMP>GMP>AMP>CMP；
② 應取pH8.0，這樣可使核苷酸帶較多負電荷，利於吸附於陰離子交換樹脂柱。雖然pH 11.4時核苷酸帶有更多的負電荷，但pH過高對分離不利。
③ 當不考慮樹脂的非極性吸附時，根據核苷酸負電荷的多少來決定洗脫速度，則洗脫順序為CMP>AMP> GMP > UMP，但實際上核苷酸和聚苯乙烯陰離子交換樹脂之間存在著非極性吸附，嘌呤鹼基的非極性吸附是嘧啶鹼基的3倍。靜電吸附與非極性吸附共同作用的結果使洗脫順序為：CMP> AMP > UMP >GMP。

③ 凝膠的生物

生物分子下游純化的對象一般包括蛋白、酶、重組蛋白、單抗、抗體及抗原、肽類、病毒、核酸等。純化前首先需要測定生物分子的各物理和化學特性，然後通過實驗選擇出最有效的純化流程。
1.測定——分子量、PI
當目標蛋白的物理特性如分子量、PI等都不清楚時，可用PAGE電泳方法或層析方法加以測定。分離范圍廣闊的Superose HR預裝柱很適合測定未知蛋白的分子量。用少量離子交換介質在多個含不同PH緩沖液的試管中，可簡易地測出PI，並選擇純化用緩沖液的最佳PH。
2.選擇——層析方法
若對目標蛋白的特性或樣品成分不太了解，可嘗試幾種不同的純化方法：
一 使用最通用的凝膠過濾方法，選擇分離范圍廣闊的介質如Superose、Sephacryl HR依據分子量將樣品分成不同組份。
二 用含專一配體或抗體的親和層析介質結合目標蛋白。亦可用各種活化偶聯介質偶聯目標蛋白的底物、受體等自製親和介質，再用以結合目標蛋白。一步即可得到高純度樣品。
三 體積大的樣品，往往使用離子交換層析加以濃縮及粗純化。高鹽洗脫的樣品，可再用疏水層析純化。疏水層析利用高鹽吸附、低鹽洗脫的原理，洗脫樣品又可直接上離子交換等吸附性層析。兩種方法常被交替使用於純化流程中。
3.純化——大量粗品
處理大量原液時，為避免堵塞柱子，一般使用sepharose big beads、sepharoseXL、sepharose fast flow等大顆粒離子交換介質。擴張柱床吸附技術利用多種STREAMLINE介質，直接從含破碎細胞或組織萃取物的發酵液中俘獲蛋白。將離心、超濾、初純化結合為一。提高回收率，縮短純化周期。
4.純化——硫酸氨樣品
硫酸氨沉澱方法常被用來初步凈化樣品，經處理過的樣本處於高鹽狀態下，很適合直接上疏水層析。若作離子交換，需先用Sephadex G-25脫鹽。疏水層析是較新技術，隨著介質種類不斷增多，漸被融入各生產工藝中。利用Hitrap HIC Test Kit 和RESOURCE HIC Test Kit可在八種疏水介質中選擇最適合介質及最佳的純化條件。低鹽洗脫的樣品可稍加稀釋或直接上其它吸附性層析。
5.純化——糖類分子
固化外源凝訂素如刀豆球蛋白、花生、大麥等凝集素，可結合碳水化合物的糖類殘基，很適合用作分離糖化細胞膜組份、細胞、甚至亞細胞細胞器，純化糖蛋白等。兩種附上外源凝集素的Sepharose 6MB親和層析介質，專為俘獲整個細胞或大復合物，如膜囊等。
6.純化——膜蛋白
膜蛋白分離常使用去污劑以保持其活性。離子性去污劑應選用與目標蛋白相反電荷者，避免在作離子交換時和目標蛋白競爭交換介質，藉此除去去污劑。非離子性去污劑可以疏水層析除去。
7.純化——單抗、抗原
單抗多為IgG.來源主要是腹水和融合瘤培養上清液。在培養前除去IgG.重組蛋白A介質Mabselect和rProtein A Sepharose FF對IgG有更高的載量和專一性，基團脫落更少。脫落的rProtein A用離子交換Q Sepharose HP或凝膠過濾Superdex 200，很容易去除。
疏水層析Phenyl Sepharose HP亦很適合純化IgG.宿主抗體和污染IgG可用凝膠過濾Superdex 200在精細純化中去除。
純化IgG抗原最有效的方法是用活化偶聯介質如CNBr、NHs activated Sepharose FF偶聯IgG，再進一步獲取IgG抗原。
HiTrap IgM是用來純化融合瘤細胞培養的單抗IgM，結合量達5mg IgM.HiTrap IgY是專門用來純化IgY，結合量達100mg純IgY.
8.純化——重組蛋白
重組蛋白在設計、構建時應已融入純化構想。樣品多夾雜了破碎細胞或溶解產物，擴張柱床吸附技術STREAMLINE便很適合做粗分離。Amersham biosciences提供三個快速表達、一步純化的融合系統。
一 GST融合載體使要表達的蛋白和谷胱甘肽S轉移酶一起表達，然後利用Glutathione Sepharose 4B作親和層析純化，再利用凝血酶或因子Xa切開。
2. 蛋白A融合載體使要表達的蛋白和蛋白A的IgG結合部位融合在一起表達，以IgG Sepharose 6 FF純化。
二 含組氨酸標記（Histidine-tagged）的融合蛋白可用Chelating Sepharose FF螯合Ni2+金屬，在一般或變性條件（8M尿素）下透過組氨酸螯合融合蛋白。HisTrap試劑盒提供整套His-Tag蛋白的純化方法。
9.純化——包涵體蛋白
包涵體蛋白往往需溶於6M鹽酸胍或8M尿素中。一般包涵體蛋白樣品的純度越高，復性效果越好。SOURCE 30 RPC反相層析介質很適合純化復性前的粗品，並可以1MnaOH重生。此方法純化後的包涵體蛋白，復性回收率明顯提高。
10.包涵體蛋白固相復性
許多文獻報導將包涵體蛋白在變性條件下固定（吸附）在層析介質上，一般用各種Sepharose FF離子交換層析介質。而且無需大量稀釋樣品，並將復性和初純化合二為一，大大節省時間及提高回收率。
固相復性方法也被用於以HiTrap Chelating金屬螯合層析直接復性及純化包涵體形式表達的組氨酸融合蛋白；以HiTrap Heparin肝素親和層析直接復性及純化包涵體形式表達的含多個賴氨酸的融合蛋白。兩種親和層析預裝柱均可反復多次重復使用，比一般試劑盒更方便、耐用。
11.純化——中草葯有效成分
中葯的化學成分極其復雜。例：如用甲醇分離黃酮甙，三糖甙先被洗下來，二糖甙其次，單糖甙隨後，最後是甙元。Sephadex LH-20可使用水、醇、丙酮、氯仿等各種試劑，廣泛用於各種天然產物的分離，包括生物鹼、甙、黃酮、醌類、內脂、萜類、甾類等。
生物鹼在酸性緩沖液中帶正電，成為鹽，HiTrap SP陽離子交換層析柱可以分離許多結構非常近似的生物鹼。相反，黃酮、蒽醌、皂甙、有機酸等可溶於偏鹼的緩沖液中，在HiTrap Q陰離子交換柱上分離效果良好。
一般多糖純化大多使用分子篩如Sephadex，Sephacryl.若分子量在600KD以下，並需更高解析度，可選擇新一代的Superdex.一般植物可能含水溶性、酸溶性、鹼溶性多種多糖。SOURCE5、15、30RPC反相層析也很適合各種中葯有效成分的檢測、分離和放大制備。由於中葯的成分非常復雜，SOURCE反相層析可用范圍為PH1-14 ，並可用1M NaOH，1M HCL清洗、再生。比傳統硅膠反相層析更易於工藝優化及在位清洗，壽命也更長。
12.純化——肽類
肽類的來源有天然萃取，合成肽和重組肽三種。肽容易被酶降解，但可從有機溶劑或促溶劑中復性，所以多以高選擇性的反相層析如SOURCE 30RPC、SOURCE 15RPC、SOURCE 5RPC或離子交換Minibeads、Monobeads作純化。Superdex Peptide HR是專為肽分子純化設計的凝膠過濾預裝柱，能配合反相層析做出更精美的肽圖。肽分子制備可用離子交換配合凝膠過濾Superdex 30 PG。醫學都市多功能
13.純化——核酸、病毒
核酸的純化用於去除影響測序或PCR污染物等研究。核酸可大致上分為質粒DNA、噬菌體DNA和PCR產物等。病毒也可視作核酸大分子，和質粒DNA一樣，可用分離大分子的Sephacry S-1000 SF、Superose或Sepharoce 4FF凝膠過濾介質去除雜蛋白，再配合離子交換如Mono Q、 SOURCE Q分離核酸。
14.純化——寡核苷酸寡酸苷酸
多應用在反義（anti-sense）DNA、RNA測序、PCR和cDNA合成等研究。合成後含三苯甲基的寡核苷酸以陰離子交換的Mono Q或快速低反壓的SOURCE Q在PH12下可除副產物，並避免凝集和保護基的脫落。載量大大高過反相層析，可用做大量制備。不含三苯甲基的失敗序列可用反相柱ProRPC去除。
15.脫鹽、小分子去除
使用凝膠過濾介質Sephadex G10，G15，G25，G50等去除小分子，效率高，處理量可達床體積30%.只需在進樣後收集首1/3-1/2柱體積的洗脫液，HiPrep Desalting（26ml）可在數分鍾為多至10ml樣品脫鹽。
16.疫苗純化
使用凝膠過濾介質Sepharose 4FF純化疫苗，去除培養基中的雜蛋白，處理量可大於床體積10%.柱高一般40-70cm，整個過程約半至一小時。使用此法生產的疫苗品種有乙肝、狂犬、出血熱、流感、肺結核、小兒麻痹疫苗等。分子量較小的疫苗可使用Sephacryl S-500HR，如甲肝疫苗等。
17.抗生素聚合物分析
中國葯典從2000年版起要求抗生素頭孢曲松鈉需要找出聚合物占產品的白分比，規定使用Sephadex G10凝膠過濾法測定。
18.純化-基因治療用病毒載體
SORRCE 15Q
19.純化-基因治療用質粒
Q Sepharose XL，SOURCE 15Q，STREAMLINE Q，Sephacryl S500，Plasmidselect 在下游純化中，可應用不同層析技術在純化生物分子的同時，去除各種污染物。 1.去除——內毒素
內毒素又稱熱原。含脂肪A、糖類和蛋白，是帶負電的復合大分子。
內毒素的脂肪A部份有很強的疏水性。但在高鹽下會凝集，無法上疏水層析。利用疏水層析試驗盒（17-1349-01）可選擇結合目標蛋白的介質而去除內毒素。
內毒素與陰離子交換介質Q或DEAE Sepharose Fast Flow有較強結合。可在洗脫目標蛋白後用高鹽緩沖液或NaOH去除。
利用CNBr或NHS Sepharose FF可偶聯內毒素底物如LAL，PMB，自動成親合層析介質結合內毒素。內毒素經常是多聚體，凝膠過濾層析可有效地將之去除。
2.去除——蛋白中的核酸
大量核酸增加樣本黏度，令區帶擴張，反壓增加，降低解析度和流速。葯審和食檢對核酸含量也有嚴格限制。
胞內表達蛋白的核酸問題尤其嚴重。核酸帶陰電荷，在初步純化時利用陽離子交換介質如STREAMLINESP，SP Sepharose Big Beads，SP或CM Sepharose FF，SP SepharoseXL結合目標蛋白，可除去大量核酸。
核酸在高鹽下會和蛋白解離，疏水層析介質很適合用來結合目標蛋白，在純化蛋白的同時去除核酸。
利用核酸酶將核酸切成小片斷，用凝膠過濾做精細純化時便很容易去除了。
3.去除——病毒和微生物
病毒和微生物可成為病原，應盡量減除。結合不同層析技術，使用注射用水，用NaOH定期進行儀器和凝膠的在位消毒和在位清洗，皆可避免污染物增加。
病毒大都有脂外殼。可用與目標蛋白電荷相反的S/D（solvent/detergent）處理，使病毒失活，如Triton和Tween.再用適當的離子交換介質如CM Sepharose FF結合目標蛋白，去除S/D.
其它污染物可以改變pH和離子強度使其從目標分子中解離或失活，凝膠過濾介質Superdex及多種吸附性介質，SOURCE都是很好的精細純化介質，可去除多種微量污染物。 凝膠是指顆粒大小在1埃到10埃之間的混合物。高分子溶液和某些溶膠，在適當的條件下，整個體系會轉變成一種彈性的半固體狀態的稠厚物質，失去流動性。這種現象稱為膠凝作用,所形成的產物叫做凝膠或凍膠.
「氣凝膠」是指分散系為氣態的，如：雲，霧等，「固凝膠」有煙水晶等，「液凝膠」就是呈液態的膠體，如氫氧化鐵膠體 。

④ 利用吸附柱純化DNA的原理是什麼

看了樓上一些回答，也是學生命類的吧？
專一性的吸附柱用的是和基因探針一樣的原理，人工合成待純化的DNA的一端一定長度序列的反義鏈，並加到吸附柱上，當混合物經過時，需要分離的DNA分子與柱上的探針結合，被留下，其餘的通過。
這樣的離心吸附柱可以高效、專一地與DNA片段結合,同時最大限度除去蛋白質、離子及引物小片段等雜質。
這樣將寡核苷酸片斷結合到柱上，可回收50
bp-50
kb
DNA片段。適用於
DNA溶液中只有單一DNA片段或溶液中所有DNA片段都需同時回收的情況。
非專一性的和樓上說的差不多。
純化柱是表面偶聯有二乙胺乙醇(DEAE)的親水性樹脂.DNA純化原理為DNA磷酸基帶負電荷,
DEAE帶正電荷,
DNA可以在0.1～1.4
mol．L-1的相當大的鹽濃度范圍內仍與DEAE
結合,
當低鹽QBT溶液平衡純化柱後,
即可加樣,
用中等鹽濃度的QC洗去RNA和其他雜質,
最後用高鹽濃度的QF將DNA洗脫下來。
由於傳統的離子交換范圍僅在0.4
mol．L-1以內,
使雜質和DNA
洗脫范圍十分接近,
難於達到滿意的純化效果.
但該柱一經使用,
6h後純化效力即開始下降。估計可能得原因有二,
一是樹脂表面親水性強,
極易吸附蛋白,
糖類,
RNA等水容物,
從而使原裝柱經幾次循環後吸附過多雜質,
影響了DEAE吸附DNA的能力,
同時雜質阻塞樹脂間隙,
使液體流過柱子的速度明顯變慢,
二是DEAE與樹脂的偶聯並不十分穩定,
在一經使用後的液體環境中,容易逐步解離.

⑤ 電泳分離四種核苷酸時，通常將緩沖液調到什麼ph

①
電泳來分離4種核苷源酸時應取pH3.5
的緩沖液，在該pH時，這4種單核苷酸之間所帶負電荷差異較大，它們都向正極移動，但移動的速度不同，依次為：UMP>GMP>AMP>CMP；
②
應取pH8.0，這樣可使核苷酸帶較多負電荷，利於吸附於陰離子交換樹脂柱。雖然pH
11.4時核苷酸帶有更多的負電荷，但pH過高對分離不利。
③
當不考慮樹脂的非極性吸附時，根據核苷酸負電荷的多少來決定洗脫速度，則洗脫順序為CMP>AMP>
GMP
>
UMP，但實際上核苷酸和聚苯乙烯陰離子交換樹脂之間存在著非極性吸附，嘌呤鹼基的非極性吸附是嘧啶鹼基的3倍。靜電吸附與非極性吸附共同作用的結果使洗脫順序為：CMP>
AMP
>
UMP
>GMP。

⑥ 在什麼pH時電泳，分離效果最好

①
電泳分離4種核苷酸時應取ph3.5
的緩沖液，在該ph時，這4種單核苷酸之間所帶負電荷差異較大，它們都向正極移動，但移動的速度不同，依次為：ump>gmp>amp>cmp；
②
應取ph8.0，這樣可使核苷酸帶較多負電荷，利於吸附於陰離子交換樹脂柱。雖然ph
11.4時核苷酸帶有更多的負電荷，但ph過高對分離不利。
③
當不考慮樹脂的非極性吸附時，根據核苷酸負電荷的多少來決定洗脫速度，則洗脫順序為cmp>amp>
gmp
>
ump，但實際上核苷酸和聚苯乙烯陰離子交換樹脂之間存在著非極性吸附，嘌呤鹼基的非極性吸附是嘧啶鹼基的3倍。靜電吸附與非極性吸附共同作用的結果使洗脫順序為：cmp>
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>gmp。

⑦ 將四種核苷酸吸附於陰離子交換柱上時，應將溶液調到什麼 ph

① 電泳分離4種核苷酸時應取pH3.5 的緩沖液，在該pH時，這4種單核苷酸之間所帶負電荷差異較大，回它們都向正極答移動，但移動的速度不同，依次為：UMP>GMP>AMP>CMP；
② 應取pH8.0，這樣可使核苷酸帶較多負電荷，利於吸附於陰離子交換樹脂柱。雖然pH 11.4時核苷酸帶有更多的負電荷，但pH過高對分離不利。
③ 當不考慮樹脂的非極性吸附時，根據核苷酸負電荷的多少來決定洗脫速度，則洗脫順序為CMP>AMP> GMP > UMP，但實際上核苷酸和聚苯乙烯陰離子交換樹脂之間存在著非極性吸附，嘌呤鹼基的非極性吸附是嘧啶鹼基的3倍。靜電吸附與非極性吸附共同作用的結果使洗脫順序為：CMP> AMP > UMP >GMP。

⑧ 請提供有關高中生物競賽生物化學的試題 拜託啦 急用

一、選擇題

1、識別密碼子GCU的反密碼子為______

2、拓撲異構酶I的功能為______

3、真核生物RNA聚合酶I轉錄的RNA為______

4、假如將15N標記的大腸桿菌在14N培養基種生長三代，提取其DNA 進行CsCl密度梯度離心，其15N，14N雜和DNA分子與純14N-DNA分子之比為______

5、多數生物體內核糖核苷酸還原成脫氧核糖核苷酸發生在______

6、氯黴素的抗菌作用是由於它______

7、真核生物體內多肽鏈合成的第一個氨基酸為______

8、用強酸性陽離子交換樹脂分離氨基酸混合物時（PH3.0上柱）與樹脂結合最牢的是______

9、競爭性抑制劑使Vmax______，Km______

10、操縱子是______

11、正協同效應的別構酶是Rs______

12、用人工合成含有兩種鹼基的多核苷酸進行體外翻譯，最可能形成的產物為______

13、甲狀腺素的作用是通過______

14、有一大腸桿菌突變株，其DNA聚合酶III的3『-5』核酸外切酶活性缺陷，它將表現出______

15、糖異生的生理作用______

16、從乳酸經糖異生形成葡萄糖共消耗______ATP

17、用於多肽鏈專一性短裂方法中選擇性最強的是______

18、三羧酸循環中所有酶都位於線粒體的基質，除了______

19、糖原是動物體內的多糖，它的結構特點是______

20、三羧酸循環中異檸檬酸脫氫酶催化的反應，被______影響

21、魚藤酮阻斷呼吸鏈是由於______

22、厭氧條件下葡萄糖酵解產物是______

23、油脂醯CoA通過β-氧化途徑和TCA途徑分解成CO2和H2O，共產生ATP數為______

24、具有不同氧化水平的一碳單位載體是______

25、糖原分解的調控______

二、是非題

1、因為α螺旋是蛋白質構象穩定的重要因素，因此蛋白質活性部位通常在α螺旋區的表面（ ）

2、糖皮質激素和腎上腺素都是提高血糖的激素（ ）

3、酶的Km值是酶的特徵常數，它不隨測定的PH和溫度而改變（ ）

4、真核生物mRNA分子兩端都有3『-OH（ ）

5、原核生物DNA為半不連續復制，真核生物DNA為全不連續復制（ ）

6、別構酶動力學曲線的特點都是呈S形曲線（ ）

7、多順反子mRNA含有多個起始密碼子和終止密碼子（ ）

8、兩條肽鏈反平行的β-折疊構象比平行的穩定（ ）

9、用SDS-PAGE電泳法測定蛋白質分子量是根據蛋白質分子所帶的電荷量而定（ ）

10、紫外線照射可引起DNA兩條互補鏈上的T之間形成二聚體（ ）

三、寫出下列縮寫的生化名稱

ACTH Cot1/2 RQ FADH2 LDL

四、寫出下列化合物的結構式

1、精氨酸

2、維生素C（還原型）

3、cAMP

4、 蔗糖（透視式）

5、 ψ

6、肌酸

7、分枝酸

8、 卵磷脂

9、11順視黃醛

10、甲狀腺素

五、填空題

1、PH8.0時，ATP帶____電荷。

2、tRNA的二級結構為____形，三級結構為____形。

3、NAD+和NADP+還原時，在____處有一個吸收峰。

4、當多肽鍵存在____殘基時，α螺旋就被中斷。

5、糖原合成酶D的別構調控物是____.

6、脂肪酸還原力的主要來源來是____途徑。

7、丙酮酸脫氫酶復合物的調節控制的方式主要有____，____和____.

8、核酸復制時，DNA聚合酶沿模板鏈____方向移動；轉錄時，RNA聚合酶沿模板鏈____方向移動；翻譯時，核糖體沿模板鏈____方向移動。

9、預使酶反應速度達到Vmax的80%，此時底物濃度應是此酶Km值的____.

10、在厭氧酵解中每消耗1克分子葡萄糖需用2克分子無機磷，催化劑用無機磷反應的酶是____.

11、從乙醯CoA合成膽固醇的限速步驟是從____形成____，由____酶催化。

12、催化氨基酸聯合脫氫酶是____和____.

13、維生素D的活性形式是____.

14、細菌的DNA連接酶以____為能量來源，動物細胞和T4噬菌體的DNA連接酶以____為能源。

15、在正常生理條件下，蛋白質分子中____和____側鏈幾乎完全帶正電荷。

16、蛋白質生物合成時，生成肽鍵的能量來自____，核糖體在mRNA上移動的能量來源為____.

17、胰凝乳蛋白酶的親和標記試劑是____，它作用於該酶活性中心的____.

18、不能進行糖異生的氨基酸是____.

六、分析和計算題

1、有一氨基酸組成為Ala，Lys，Phe，的七肽，將它與FDNS反應，經酸水解後，生成游離的DNP-Ala.將它用胰蛋白酶酶解，則得到一個三肽和一個四肽，它們的組成分別為：3Ala，Phe和Lys，2Ala.將它用胰凝乳蛋白酶酶解，則生成一個六肽與一個游離的Ala.試寫出其氨基酸順序。

2、今有以下4種蛋白質的混合物：（1）分子量12，000，pI=10；（2）分子量62，000，pI=4；（3）分子量28，000，pI=7；（4）分子量9，000，pI=5；若不其它因素，當它們

（A）流過DEAE-纖維素陰離子交換柱，用線性鹽梯度洗脫時；（B）流經Sephadex G-50凝膠過 濾柱時，這些蛋白質的洗脫順序如何？

3、若用14C標記 下列化合物，經一次TCA循環後，試問14C出現在什麼化合物的什麼部位上？

(1)H310C____C____COO- (2)H3C-C____14COO-
|| ||
O O

4、假如突變導致脂肪細胞中過多產生依賴cAMP的蛋白激酶，試問影響脂肪酸代謝的突變效應是什麼？

5、已知cccDNA每結合一個嵌合染料菲啶溴紅分子，雙螺旋將解開26.左右，有一DNA制劑，加入菲啶溴紅使其沉降系數達到最低值，此時每個核苷酸平均結合菲啶溴紅分子樹為0.07，求此DNA制劑的負超螺旋密度數值。

6、葉綠體在充分光照，25.C，PH7.0的條件下，ATP，ADP，和Pi濃度分別為100，1和100uM

（1）計算合成1克分子ATP需要多少自由能。

（2）為了合成ATP一對電子傳遞的最低電位是多少？

7、某酶的Km為4.0X10-5M，Vmax=24微克分子/升/分鍾，計算出當底物濃度為2X10-4M，非競爭性抑制劑濃度為6.0X10-4M，如Ki為3.0X10-4M時的抑制百分數。

⑨ 能不能用電泳的方法分離核酸，為什麼

① 電泳分離4種核苷酸時應取pH3.5 的緩沖液，在該pH時，這4種單核苷酸之間所帶負電荷差異較大，它們都向正極移動，但移動的速度不同，依次為：UMP>GMP>AMP>CMP；
② 應取pH8.0，這樣可使核苷酸帶較多負電荷，利於吸附於陰離子交換樹脂柱。雖然pH 11.4時核苷酸帶有更多的負電荷，但pH過高對分離不利。
③ 當不考慮樹脂的非極性吸附時，根據核苷酸負電荷的多少來決定洗脫速度，則洗脫順序為CMP>AMP> GMP > UMP，但實際上核苷酸和聚苯乙烯陰離子交換樹脂之間存在著非極性吸附，嘌呤鹼基的非極性吸附是嘧啶鹼基的3倍。靜電吸附與非極性吸附共同作用的結果使洗脫順序為：CMP> AMP > UMP >GMP。