離子交換層析法分離氨基酸

A. 急求：離子交換柱層析分離氨基酸的講義

一、目的

學慣用陽離子交換樹脂柱分離氦基酸的操作方法和基本原理。

二、原理

各種氨基酸分子的結構不同，在同一PH時與離子交換樹脂的親和力有差異，因此可依親和力從小到大的順序被洗脫液洗脫下來，達到分離的效果。

三、器材

1、20cmX 1cm層析管 2、試管

3、吸管． 4、恆壓洗脫瓶

5、部分收集器 6、搪磁杯

7、電爐 8、分光光度計

四、試劑和材料

1、．苯乙烯磺酸鈉型樹脂（強酸 lx 8，l00一200目，可用上海華東化工學院產品）

2 、2 mol／L鹽酸溶液

3、2mol／L氫氧化鈉溶液

4、標准氨基酸溶液 天冬氨酸、賴氨酸和組氨酸均配製成 2 mg／mL的0.1M鹽酸溶液。

5、混合氫基酸溶液將上述天冬氨酸、賴氨酸和組氨酸溶液按1：2．5：10的比例混合。

6、檸檬酸－氫氧化鈉一鹽酸沖液（pH5.8），鈉離子濃度0 .45M）

取檸檬酸（C6O7H8.H20 ）14.25g、氫氧化鈉9.30g和 濃鹽酸 5．25 mL溶於少量水後，定容至 500 mL，冰箱保存。

7、顯色劑 2 g水合茚三酮溶於 75mL乙二醇單甲醚中．加水至 100 mL。

8、50%乙醇水溶液

五、操作

1、層析柱的准備：將強酸型陽離子交換樹脂用氫氧化鈉處理成Na+型後洗至中性（處理方法見第三篇實驗十二）．攪拌一小時後裝成一個直徑1cm．高 16～18 cm的層析柱。

2、氨基酸的洗脫：用P H5.8的檸檬酸緩沖液流洗平衡交換住（裝置如圖）。調節流速為 0.5 mL／min，流出液達床體積的4倍時即可上樣。由柱上端仔細加人氨基酸混合液0．25—0．5 mL，同時開始收集流出液。當樣品液彎月面靠近樹脂頂端時，即刻加入0.5 mL擰檬酸緩沖液沖洗加樣品處。待緩沖液彎月面靠近樹脂頂端時。再加入0．5 mL緩沖液。如此重復兩次，然後用滴管小心注入檸檬酸緩沖液（切勿攪動床面），並將柱與洗脫瓶和部分收集器相連。開始用試管收集洗脫液，每管收集lmL．共收集60一80管。

3、氨基酸的鑒定：向各管收集液中加lmL水合茚三酮顯色劑並混勻，在沸水浴中淮確加熱15分鍾後冷卻至室溫．再加15 mL的50％乙醇液。放置10分鍾。以收集液第2管為空白，測定A570nm波長的光吸收值。以光吸收值為縱坐標，以柱洗脫體積為橫坐標繪制洗脫曲線。以已知3種氨基酸的純溶液為樣品，按上述方法和條件分別操作，將得到的洗脫曲線與混合氨基酸的洗脫曲線對照．可確定3個峰的大致位置及各蜂為何種氨基酸。

B. 離子交換層析法是能分離所有的氨基酸嗎

首先了復解一下離子交制換層析的原理，離子交換層析是用離子交換劑作固定相，利用它與流動相中的離子能進行可逆的交換性質來分離離子型化合物的層析方法。帶電荷量少，親和力小的先被洗脫下來；帶電荷量多，親和力大的後被洗脫下來。因此氨基酸由於所帶電荷量的不同而被逐一洗脫分離開。

C. 利用陽離子交換層析分離下列每一對氨基酸，哪一種氨基酸首先被PH7緩沖液從離子交換柱上洗脫出來。

氨基酸與粒子交復換樹脂的制吸附力大小取決於它們之間的電荷引力和疏水作用。第一組中甘氨酸和亮氨酸均為非極性氨基酸，但是相比之下甘氨酸的極性要更強，也就是疏水性更弱，它會先被洗脫。第二組中，絲氨酸是中性條件下不帶電荷的極性氨基酸，丙氨酸是非極性氨基酸，所以絲氨酸疏水性差，先被洗脫。

D. 用強酸性陽離子交換樹脂分離氨基酸混合物時，為什麼要逐步提高洗脫液的pH和離子強度

用強酸性陽抄離子交換樹脂分離氨基酸混合物時，氨基酸都是以陽離子的形式，被吸附到樹脂的離子交換位上。
由於氨基酸是兩性化合物，既有酸性，也有鹼性，因此氨基酸都有等電點，pH低於等電點時，呈陽離子狀態，pH高於等電點時，呈陰離子狀態。氨基酸被強酸性離子交換樹脂吸附後，都是以陽離子形式存在的，轉變為陰離子就會被洗脫。通過逐漸提高洗脫液的pH，利用氨基酸不同的等電點，使不同的氨基酸逐漸從陽離子改變為陰離子，而被洗脫出來，從而達到分離效果。

E. 離子交換柱層析法分離氨基酸實驗的結論是

氨基酸有不同的等電點

F. 什麼因素可影響離子交換柱層析法分離氨基酸

柱溫；
柱長徑比；
進料量；
進料濃度；
洗脫速度；
洗脫液pH；
交換柱配體的極性強弱；
樹脂交聯度；
樹脂粒徑等因素都會有影響。

G. 20種氨基酸用離子交換層析法分離順序

這看你用什麼填料進行交換層析了，還有離子交換緩沖液的pH多少。
因為氨基酸有酸性氨基酸、鹼性氨基酸以及中性氨基酸。不同交換條件分離順序不同。

H. 離子交換層析分離氨基酸時，（苯乙烯磺酸鈉）為什麼組氨酸後洗脫出來而賴氨酸先洗脫出來

你們是不是這樣分析的：組氨酸的PI是7.59，賴氨酸是9.74，這證明賴氨酸鹼性更強，酸性更弱，而內用H+洗脫時，先洗脫是應容該是酸性弱的物質所以賴氨酸應該先洗脫下來？
或許可以這樣解釋：鹼性氨基酸和陽離子交換樹脂的結合是以氫離子為媒介，藉助氫鍵的極性連接起來的。如果我沒記錯的話，伯氨基形成的氫鍵要比仲氨基形成的氫鍵強一些。
不管用是鈉型的還是氫型的陽離子交換樹脂，組氨酸和賴氨酸要與其吸附都必需通過氫離子。鈉型的陽離子交換樹脂並是不所有的磺酸基都與鈉離子結合的。你用平衡常數算一下。而且，你用來溶解氨基酸的溶液是強鹼性的嗎？你的樹脂是再生的嗎？

I. 如何應用離子交換層析分離氨基酸混合物

離子交換樹來脂是一種合成的高聚物源,不溶於水,能吸水膨脹.高聚物分子由能電離的極性基團及非極性的樹脂組成.極性基團上的離子能與溶液中的離子起交換作用,而非極性的樹脂本身物性不變.通常離子交換樹脂按所帶的基團分為強酸(＝R＝S03H)