蛋白質的離子交換層析實驗報告
㈠ 離子交換層析法分離單核苷酸 求一份實驗結果
氨基酸的分離鑒定——紙層析法
一,實驗目的
掌握氨基酸紙層析的方法和原理,學會分析待
測樣品的氨基酸成分.
二,實驗原理
紙層析是以濾紙為惰性支持物的分配層析.濾紙纖維上的羥基具有親水性,吸附一層水作為固定相,有機溶劑為流動相.當有機相流經固定相時,物質在兩相間不斷分配而得到分離.
溶質在濾紙上的移動速度用Rf值表示:
Rf=原點到層析斑點中心的距離/原點到溶劑前沿的距離
在一定的條件下某種物質的Rf值是常數.Rf值的大小與物質的結構,性質,溶劑系統,層析濾紙的質量和層析溫度等因素有關.本實驗利用紙層析法分離氨基酸.
三,實驗器材
(1)大燒杯(5000mL):1隻/組
(2)微量注射器(100 L):1隻/ 組.
(3)噴霧器:公用.
(4)培養皿:1隻/組.
(5)層析濾紙(長22cm,寬14cm的新華一號濾紙):1張/組.
(6)直尺,鉛筆:自備.
(7)電吹風:1隻/組.
(8)托盤,針,白線:1套/組.
(9)手套:1雙/組.
(10)塑料薄膜:公用.
(11)小燒杯:50mL,1隻/組.
四,實驗試劑
(1)擴展劑:將4體積正丁醇和1體積冰醋酸放入分液漏斗中,與5體積水混合,充分振盪,靜置後分層,棄去下層水層.
(2)氨基酸溶液:0.5%的已知氨基酸溶液3種(賴氨酸,苯丙氨酸,纈氨酸),0.5%的待測氨基酸液1種.
(3)顯色劑:0.1%水合茚三酮正丁醇溶液.
實驗試劑
五,實驗操作
檢查培養皿是否乾燥,潔凈;若否,將其洗凈並置於乾燥箱內120℃烘乾.
(1)平衡:剪一大塊塑料薄膜鋪在桌面上,將層析缸或大燒杯到置於塑料薄膜上,再把盛有約20mL展層溶液的小燒杯置於倒置的層析缸或大燒杯中,用塑料薄膜密封起來,平衡20min.
(2)規劃:帶上手套,取寬約14cm,高約22cm的層析濾紙一張.在紙的下端距邊緣2cm處輕輕用鉛筆劃一條平行於底邊的直線A,在直線上做4個記號,記號之間間隔2cm,這就是原點的位置.另在距左邊緣1cm處畫一條平行於左邊緣的直線B,在B線上以A,B兩線的交點為原點標明刻度(以厘米為單位),參見左圖.
(3)點樣:用微量注射器分別取10mL左右的氨基酸樣品(每取一個樣之前都要用蒸餾水洗滌微量注射器,以免交叉污染),點在這四個位置上.擠一滴點一次,同一位置上需點2～3次,2～3mL/次,每點完一點,立刻用電吹風熱風吹乾後再點,以保證每點在紙上擴散的直徑最大不超過3mm.每人須點4個樣,其中3個是已知樣,1個是待測樣品.
(4)層析:用針,線將濾紙縫成筒狀,紙的兩側
邊緣不能接觸且要保持平行,參見圖3-3.向培養皿中加入擴展劑,使其液面高度達到1cm左右,將點好樣的濾紙筒直立於培養皿中(點樣的一端在下,擴展劑的液面在A線下約1cm),罩上大燒杯,仍用塑料薄膜密封.當擴展劑上升到A線時開始計時,每隔一定時間測定一下擴展劑上升的高度,填入表3-1中.當上升到15～18cm,取出濾紙,剪斷連線,立即用鉛筆描出溶劑前沿線,迅速用電吹風熱風吹乾.
(5)顯色:用噴霧器在通風廚中向濾紙上均勻噴上0.1%茚三酮正丁醇溶液,然後立即用熱風吹乾,即可顯出各層析斑點,參見左圖.
(6)計算各種氨基酸的Rf值,並判斷混合樣品中都有哪些氨基酸,各人將自己的實驗結果貼在實驗報告上,見表3-2.
(7)以層析時間為橫坐標,擴展劑上升高度為縱坐標畫圖,求出擴展劑上升到18cm時所需要的時間.
(8)將微量注射器內外用蒸餾水清洗干凈,倒掉用過的展層液和平衡液,將培養皿洗凈,整理好桌面上的儀器和試劑
㈡ 離子交換層析法分離純化蛋白質有哪些局限性
因為離子交換吸附蛋白質並不是特異性吸附，在某些情況下可能難以判斷結合的蛋版白質權是否為當初設計的目的蛋白。
離子交換吸附依賴於蛋白質表面的靜電荷，如果蛋白質結構比較特殊，可能會有在各種pH都難以結合上離子交換層析的情況。
離子交換層析對於等電點與目標蛋白接近的雜蛋白並沒有很好的分離效果。
㈢ 離子交換層析在蛋白質分離中的應用
離子交換層析在蛋白質分離純化中有非常廣泛的應用，在樣品富集，中度純化和精製階段都可以採用。另外還可以利用離子交換層析去除DNA和內毒素。因此在生物製品工藝中應用非常廣泛。關鍵是要選擇合適的介質和分離條件。
你的問題范圍太廣，如果有具體的問題可以詳細討論。
㈣ 在離子交換層析中剛開始鹽梯度洗脫蛋白質就都被洗下來了，要怎麼處理這個問題
可以調節流動相的ph值試試
㈤ 凝膠過濾層析和離子交換層析分離蛋白質的原理有何不同
所有的層析在原理上都是相通的，區別在於流動相和層析劑之間的作用力的不同。
離子交換是利用蛋白質表面的電荷與層析劑上的離子基團的靜電作用。
凝膠過濾層析利用了凝膠的多孔性，根據溶劑分子的大小進行分離。
㈥ 離子交換層析為什麼在低離子強度下進行
離子交換層析是根據蛋白質所帶電荷的差異進行分離純化的一種方法。回蛋白質的帶電性是由蛋答白質多肽中帶電氨基酸決定的。由於蛋白質中氨基酸的電性又取決於介質中的pH，所以蛋白質的帶電性也就依賴於介質的pH。當pH較低時，負電基團被中和，而正電基團就很多; 在pH較高時，蛋白質的電性與低pH時相反。當蛋白質所處的pH，使蛋白質的正負電荷相等，此時的pH稱為等電點。離子交換層析所用的交換劑是經酯化、氧化等化學反應引入陽性或陰性離子基團製成的，可與帶相反電荷的蛋白質進行交換吸附。帶有陽離子基團的交換劑可置換吸附帶負電荷的物質，稱為陰離子交換劑，如DEAE-纖維素樹脂;反之稱為陽離子交換劑，如CM-纖維素樹脂。不同的蛋白質有不同的等電點，在一定的條件下解離後所帶的電荷種類和電荷量都不同，因而可與不同的離子交換劑以不同的親和力相互交換吸附。當緩沖液中的離子基團與結合在離子交換劑上的蛋白質相競爭時，親和力小的蛋白質分子首先被解吸附而洗脫，而親和力大的蛋白質則後被解吸附和洗脫。因此，可通過增加緩沖液的離子強度和/或改變酸鹼度，便可改變蛋白質的吸附狀況，使不同親和力的蛋白質得以分離。
㈦ 離子交換層析和親和層析都可以用來分離所有的蛋白質嗎
理論上來說離子交抄換層析可以用襲來分離所有的蛋白質，但親和層析只能分離能和其特異性結合或者說帶tag的蛋白質。
從實際應用來說，離子交換層析不可能能用來分離所有的蛋白質。這是因為其解析度沒有辦法達到分離所有蛋白質。而且蛋白與蛋白之間可能存在其他的相互作用，造成某個鹽濃度下被洗脫的蛋白可能會吸附其他蛋白一起被洗脫，達不到分離的效果
親和層析就更不可能分離所有的蛋白質了，不管是哪種親和層析都有對應可以特異性吸附的親和標簽蛋白。如果沒有親和標簽，所有的蛋白都是不能吸附的
㈧ 離子交換層析可用於哪些種類蛋白質的分離
離子來交換層析是利用蛋白質在不同自PH帶不同種電荷的方法，利用離子交換的方法分離蛋白的。
離子交換內的介質一般是樹脂，陽離子交換型的，使用前樹脂先用鹼處理成鈉型，將氨基酸混合液（pH=2-3)上柱，pH=2-3時，氨基酸主要以陽離子形式存在，與樹脂上的鈉離子發生交換而被「掛」在樹脂上，再用洗脫劑洗脫。不同的氨基酸（帶的電荷不同）與樹脂的親和力不同，要將其分離洗脫下來，需要降低它們之間的親和力，方法是逐步提高洗脫劑的pH和鹽濃度，這樣各種氨基酸將以不同的速度被洗脫下來，反之亦然。
不同反荷離子與樹脂親和力是不同的，其強弱關系為陽性競爭離子：Ag+〉CS+〉K+〉NH4+〉Na+〉H+〉Li+ 陰性競爭離子：I->NO3->(PO4)3->CN-〉HSO3-〉Mg2+〉HCO3-〉HCOO-〉CH3COO-〉OH-〉F- 如果某種離子溶液洗脫效果不好，可用另一種親和力強的離子代替之，等電點＞7選擇陽離子交換樹脂，等電點＜7選擇陰離子交換樹脂。
㈨ 20種氨基酸用離子交換層析法分離順序
這看你用什麼填料進行交換層析了，還有離子交換緩沖液的pH多少。
因為氨基酸有酸性氨基酸、鹼性氨基酸以及中性氨基酸。不同交換條件分離順序不同。