滤膜过滤法测纯水菌落总数

1. 纯化水微生物限度检查方法

4.10微生物限度(薄膜过滤法)
4.10.1取相当于每张滤膜含1g或1ml供试品供试液加至适量稀释剂混匀过滤若供试品每1g或1ml所含菌数较多时取适量稀释剂供试液1ml过滤用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或其适宜冲洗液冲洗滤膜冲洗方法和冲洗量同计数方法验证冲洗取出滤膜菌面朝上贴于营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基平板上培养每种培养基至少制备张滤膜
4.10.2阴性对照试验
取试验用稀释液1ml照上述薄膜过滤法操作作阴性对照阴性对照得有菌生长
4.10.3培养和计数
除另有规定外细菌培养48小时逐日点计菌落数般48小时菌落数报告;霉菌、酵母菌培养72小时逐日点计菌落数般72小时菌落数报告;必要时适当延长培养时间至5~7天进行菌落计数并报告菌落蔓延生长成片平板宜计数点计菌落数计算各稀释级供试液平均菌落数按菌数报告规则报告菌数若同稀释级两平板菌落平均数少于15则两平板菌落数能相差1倍或上
4.10.4菌数报告原则
相当于1g或1ml供试品菌落数报告菌数;若滤膜上无菌落生长<1报告菌数(每张滤膜过滤1g或1ml供试品)或<1乘稀释倍数值报告菌数
我们公司纯化水微生物检测部分内容请参考

2. 用滤膜法测细菌总数,该如何处理

基于滤膜上细菌直接计数法的细菌总数快速检测
【摘要】 细菌总数快速检测在质量监测中具有重要的意义，目前除了经典的平板培养法以外，还有微菌落法、阻抗法等快速检测方法，这些方法或者需要较长的检测时间，或者需要较高的检测成本。本研究提出一种不需要培养而在滤膜上直接计数的细菌总数的快速检测方法，它主要分为过滤、染色、显微镜计数和计算四个步骤。计算细菌总数时，根据细菌在滤膜上的分布特点，对传统公式进行改进，提出按区域计算细菌总数的计算方法，提高了检测精度。研究结果表明，该方法与传统的平板培养法无显著性差异（t=0.847，P=0.436＞0.05），是一种低成本、快速的细菌总数检测方法。
1 引 言

细菌总数计数的研究已有很多，目前国标规定的方法为平板计数法，该方法是将样品加入琼脂营养基，在37 ℃下培养24～48 h后计数。这种方法精度高，但耗时长，难以满足实际工作需要。为了简化检测程序、缩短检测时间，国内外学者进行了大量的快速检测方法的研究，提出了阻抗检测法〔1〕、Simplate TM全平器计数法〔2〕、微菌落技术〔3-5〕、纸片法〔6-7〕等检测方法，取得了一定的成果，但检测时间仍在4 h以上。

本研究在分析了已有研究成果的基础上，提出了在滤膜上染色后，直接计数的细菌总数检测方法，具体步骤为：用集菌仪进行细菌收集→在膜上进行染色→在油镜下计数→按公式计算出菌液浓度。实验结果表明，该方法与传统的平板培养法无显著性差异，检测时间约1 h，是一种快速的细菌总数检测方法。

2 材料与方法

2.1 材料

本研究中用的试验材料有集菌仪（杭州泰林生物技术设备有限公司），染色剂，生物显微镜（宁波永新光学股份有限公司），聚碳酸脂膜（直径47 mm）。

2.2 实验方法

2.2.1 准备工作 卸下集菌仪的滤网（见图1），统计滤网上小孔总数，为计算菌液浓度做准备。另外，还需对集菌仪中的集菌器进行高压灭菌，以防止过滤过程中引入外源细菌。

2.2.2 细菌收集 取一定浓度的霉菌菌液300～500 ml，装在集菌仪上，集菌仪采用蠕动加压方式对菌液施加一定的压力，使菌液流过孔径为0.45 um的聚碳酸脂膜。采用过滤方法是因为它可以使细菌相对均匀地分布在滤膜上，而选用聚碳酸脂膜是因为这种膜具有良好的透光性，便于用显微镜观察。

2.2.3 染色 集菌后取下滤膜，切下一部分放在载玻片上，进行染色、固定。染色的目的是增大细菌与背景的对比度，便于观察。

2.2.4 显微镜计数与计算 菌液经集菌仪过滤后，细菌在滤膜上的分布见图2、图3，由图可以看出细菌分布具有以下两个特点：一是细菌集中在一个个的圆形区域内，这些圆形区域和挡板的小孔相对应；二是各个圆形区域之间细菌很少。根据膜上细菌分布的这种特点，提出以圆形区域为单位进行计数，统计出圆形区域内细菌的平均个数，从而计算出菌液中细菌总数。具体步骤如下：随机选择10个圆形区域，在油镜下，调节焦距以获得较清晰的图像（见图4），统计每个圆形区域内的细菌个数，然后按公式(1)计算出菌液的浓度。

X=A10×N/V(1)图2 膜上细菌的区域分布

Fig 2 The distributing region of bacteria on the filter(100倍)

图3 膜上细菌的区域间隔

Fig 3 The space among the distributing regions(100倍)

图4 膜上细菌染色后图像

Fig 4 Figure of bacteria after coloration(1 000倍)

式中：X表示待检菌液浓度（CFU/ml）

A表示10个圆形区域内细菌总数

N表示滤网上小孔总数

V表示集菌时所用待检菌液体积（ml）

3 结果与讨论

3.1 实验结果

按上述方法计算得到的结果与平板培养法得到的结果见表1。表1 两种方法得到的细菌总数

Table 1 Total bacteria number by two different methods

样本1样本2样本3样本4样本5样本6染色镜检

(cfu/ml）185168157165171166平板培养

(cfu/ml)176155165158183152

对表1中两组数据进行配对t检验，在α=0.05时，双尾检验结果如下：t=0.847，P=0.436＞0.05，说明两种方法得到的结果无显著性差异。

3.2 讨论

3.2.1 计算公式的改进 用集菌仪对样本菌液进行过滤时，由于滤网挡板的作用，使得细菌不是均匀地分布在整个滤膜上，而是集中分布在滤网的小孔处，所以，计算细菌总数时，不能采用公式X=A40×Φ1Φ22/V（其中Φ1，Φ2分别为滤膜直径和视野直径），该公式是微菌落方法检测细菌总数中的常用计算公式。在本实验中，根据细菌分布的特点，提出以圆形区域为单位计算细菌总数的思路，使计算结果更接近真实值，从而提高了检测精度。

3.2.2 细菌大小的影响 细菌大小对本实验的影响主要体现在镜检时，如果细菌太小，显微镜计数时不能将细菌从背景中分辨出来，我们的实验结果显示，不能分辨大肠杆菌和葡萄球菌，而较大的霉菌可以清晰地分辨。

3.2.3 检测时间进一步缩短 细菌总数的经典检测方法是平板培养法，得到的结果精度高，但是它所用时间长，为了缩短检测时间，出现了微菌落法，将检测时间缩短为4 h左右〔3-5〕。本研究不对细菌进行培养，而是在膜上染色后直接用显微镜计数，最大限度地缩短了检测时间，使整个检测时间在1 h左右。

4 结论

本研究用集菌仪将菌液过滤后，取滤膜一部分进行染色、制片，然后在油镜下统计细菌个数。根据细菌在滤膜上的分布特点，提出将圆形区域作为统计单位，得到圆形区域内细菌的平均个数，从而计算出菌液浓度。实验结果表明，按照该方法得到的结果与平板培养法的结果无显著性差异。与平板培养法和微菌落法相比，该方法不需要细菌培养，检测时间只需要1 h左右，明显缩短了检测时间，是一种快速、有效的细菌总数检测方法。

3. 纯化水进行微生物限度检测，使用薄膜过滤法应该取多少

准备工作：用纯抄化水浸泡滤膜袭，浸泡完全后放入滤杯中，包好滤杯，连同量筒、培养基、平皿、取膜器、三角烧瓶等一起121℃灭菌30min。灭菌后的物品一并传入洁净室中，微生物限度过滤器上连好已经灭好的滤杯，用缓冲液先润湿滤膜，抽掉缓冲液，然后倒入供试液（10倍稀释），滤过，再用缓冲液冲洗滤膜。过滤结束后取下滤膜平贴于R2A琼脂培养基平板上，32℃倒置培养5天。菌落计数（平皿上长几个菌结果就报几个菌）

4. 薄膜过滤法，纯化水的微生物限度检验，都需要什么设备

准备工作：
用纯化水浸泡滤膜，浸泡完全后放入滤杯中，包好滤杯，连同量筒、培养基、平内皿、取膜器容、三角烧瓶等一起121℃灭菌30min。
灭菌后的物品一并传入洁净室中，微生物限度过滤器上连好已经灭好的滤杯，用缓冲液先润湿滤膜，抽掉缓冲液，然后倒入供试液（10倍稀释），滤过，再用缓冲液冲洗滤膜。
过滤结束后取下滤膜平贴于R2A琼脂培养基平板上，32℃倒置培养5天。
菌落计数（平皿上长几个菌结果就报几个菌）

5. 平板计数法和膜过滤法检测细菌有什么区别呢 哪个精确一些

膜过滤法更为精确一些。
膜过滤技术是成熟的技术，ISO标准、AOAC、美国的等等。所有这些标准，最起码ISO标准是可以拿过来用的。采用滤膜法进行微生物检测是一种国际公认的微生物标准检验方法，其得到AOAC、美国、欧洲和日本等国家的药典、FDA和EPA等组织的承认，广泛应用于环境监测、食品及饮料工业、化妆品、制药工业品质控制和电子工业等领域。赛多利斯公司的滤膜法微生物检测产品成功地应用于滤膜法已有20多年的历史，实用而且方便实用，它简化了微生物检测程序。 所以，1.有菌落总数检测膜过滤法的标准。2.有可行性。
标准和技术是两码事，标准的制定主要是为了评价水平和保护安全。
2.关于平皿计数法检不出，而滤膜法却能检测出，可想到以下两点：1）平皿计数法，倾倒的培养基也要50度左右，而50度左右足矣使部分环境微生物不能生长了；2）在培养基内部的微生物比在表面的获得更少的氧，应该也是会影响部分微生物的生长。膜过滤法是水质样品的国际上公认的方法，有依据可查。主要起到一个富集的作用 毕竟水中的菌比较分散。
滤膜法微生物检测： 将适当孔径的滤膜放入滤器，过滤样品，由于滤膜的作用而将微生物保留在膜的表面上。样品中微生物生长抑制剂可在过滤后用无菌水冲洗滤器而除去。然后，将滤膜放在培养基上培养，营养物和代谢物通过滤膜的微孔进行交换，在滤膜表面上培养出的菌落可以计数，并和样品量相关。
滤膜法的优点：
-与直接法比较，可以检测大量的样品
- 浓缩效应使微生物检测的准确度提高
- 带有菌落的滤膜，可作为检测的永久记录存档
- 可见的菌落和样品量直接对应，得出定量结果

6. 关于菌落总数测定

楼主你该问的不问，不该问的却问了。

早有耳闻新版国家标准有误，也不知道哪个家伙审的稿，那么白痴的公式说明居然都会放出来当标准，真是被同行笑话。

公式没错。
错的是n1和n2代表的是平板数，而不是菌落数！

计算样品的总菌落数或者单位体积内的菌落数，无非就是抽取一部分样品液体适当稀释使其长出便于计数的菌落。然后把计数得到的菌落的总数除以涂平板用掉的体积，就是稀释液中的菌体密度，再乘以稀释的倍数，不就是原来样品的菌体密度嘛。

原理就是这么简单。
这里所谓的稀释因子就是换算到样品密度所需要乘的系数。
举例：1g样品用10ml水充分悬浮，将悬浮液稀释了100倍后发现菌落疏密适宜，且之后的稀释1000也是适宜，这两个稀释度各有3个平板可用于计数，总共计数得660个菌落，每次涂布用200μL。因为你稀释1000倍的液体是将100倍的稀释液再稀释十倍所得，所以1000倍稀释液涂的十个板相当于是100倍稀释液的一个板。
100倍稀释液的菌体密度就是660个除以（3×0.2+0.3×0.2）ml，既然100倍稀释液的密度知道了，那么稀释前的就是乘上100，提取0.2的公因子，得500，也就是稀释的倍数，就是所谓的稀释因子。
原来样品的悬浮液的菌体密度是660个除以（3+0.3）ml再乘上500的稀释因子。
如果你要计算菌落总数，那么稀释因子就再算上悬浮的10ml，也就是660÷3.3再乘500×10等于1100000个。
总结一下，如果是计算菌落总数而不是密度，稀释因子就是悬浮液体积乘以第一个适宜度的稀释倍数除以每次涂布用掉稀释液体积。

明白了不？

标准原文中分子分母的单位都是个数，一比之后量纲为1，一看就是不对的。

7. 有测过纯化水系统取样点菌落总数的吗结果大约多少我的结果不超过10个每毫升

一般纯净水和普通纯化水的限度跟自来水是一样的100CFU/mL

但是反渗透设备的警戒限度一专般设置在50，超过50就说明你设属备可能有问题了，需要杀菌了
一旦到了50很快就会到100,500

你这个是10的话，是正常水平

8. 纯水怎样做细菌检测

滤膜法微生物检测：
将适当孔径的滤膜放入滤器,过滤样品,由于滤膜的作用而回将微生答物保留在膜的表面上.样品中微生物生长抑制剂可在过滤后用无菌水冲洗滤器而除去.然后,将滤膜放在培养基上培养,营养物和代谢物通过滤膜的微孔进行交换,在滤膜表面上培养出的菌落可以计数,并和样品量相关.
滤膜法的优点：
- 与直接法比较,可以检测大量的样品
- 浓缩效应使微生物检测的准确度提高
- 带有菌落的滤膜,可作为检测的永久记录存档
- 可见的菌落和样品量直接对应,得出定量结果
操作具体一点就是：薄膜过滤法检测,一个样过滤一份,就是200ml的纯化水通过滤膜,将该滤膜浸泡在灭菌好的l生理盐水中,再接种到平皿中,制成10级、100级、1000级稀释倍数的细菌、霉菌和酵母菌稀释培养皿,即可

9. 菌落总数测定可以采用膜过滤法吗有参考标准吗

可以
水样微生物检测5750.12中有，
但主要看你的标准要求是多少

10. 纯化水微生物限度检查用薄膜过滤法怎么做

准备工作：

用纯化水浸泡滤膜，浸泡完全后放入滤杯中，包好滤杯，连同量专筒、培养基、平皿、属取膜器、三角烧瓶等一起121℃灭菌30min。

灭菌后的物品一并传入洁净室中，微生物限度过滤器上连好已经灭好的滤杯，用缓冲液先润湿滤膜，抽掉缓冲液，然后倒入供试液（10倍稀释），滤过，再用缓冲液冲洗滤膜。

过滤结束后取下滤膜平贴于R2A琼脂培养基平板上，32℃倒置培养5天。菌落计数（平皿上长几个菌结果就报几个菌）

(10)滤膜过滤法测纯水菌落总数扩展阅读：

薄膜过滤系统主要用于去除小颗粒及溶解盐，一般可分为微滤、超滤、纳滤和薄膜过滤反渗透。

微滤又称微孔过滤，它属于精密过滤，截留溶液中的砂砾、淤泥、黏土等颗粒和贾第虫、隐抱子虫、藻类和一些细菌等，而大量溶剂、小分子及少量大分子溶质都能透过膜的分离过程。

超滤是一种加压膜分离技术，即在一定的压力下，使小分子溶质和溶剂穿过一定孔径的特制的薄膜，而使大分子溶质不能透过，留在膜的一边，从而使大分子物质得到了部分的纯化

纳滤 ( NF，Nanofiltration)是一种介于反渗透和超滤之间的压力驱动膜分离过程，纳滤膜的孔径范围在几个纳米左右。

参考资料来源：网络-薄膜过滤