将4种核苷酸吸附于阴离子交换柱上

① 简述核酸分离的基本 原理

核酸分离与纯化的原则
核酸在细胞中总是与各种蛋白质结合在一起的。核酸的分离主要是指将核酸与蛋白质、多糖、脂肪等生物大分子物质分开。在分离核酸时应遵循以下原则:保证核酸分子一级结构的完整性;排除其他分子污染。

核酸分离与纯化的步骤
大多数核酸分离与纯化的方法一般都包括了细胞裂解、酶处理、核酸与其他生物大分子物质分离、核酸纯化等几个主要步骤。每一步骤又可由多种不同的方法单独或联合实现。
1. 细胞裂解:核酸必须从细胞或其他生物物质中释放出来。细胞裂解可通过机械作用、化学作用、酶作用等方法实现。
(1) 机械作用:包括低渗裂解、超声裂解、微波裂解、冻融裂解和颗粒破碎等物理裂解方法。这些方法用机械力使细胞破碎,但机械力也可引起核酸链的断裂,因而不适用于高分子量长链核酸的分离。有报道超声裂解法提取的核酸片段长度从< 500bp ～ > 20kb 之间,而颗粒匀浆法提取的核酸一般< 10kb。
(2) 化学作用:在一定的p H 环境和变性条件下,细胞破裂,蛋白质变性沉淀,核酸被释放到水相。上述变性条件可通过加热、加入表面活性剂(SDS、Triton X-100 、Tween 20 、NP-40 、CTAB、sar-cosyl 、Chelex-100 等) 或强离子剂(异硫氰酸胍、盐酸胍、肌酸胍) 而获得。而p H 环境则由加入的强碱(NaOH) 或缓冲液 ( TE、STE 等) 提供。在一定的p H 环境下,表面活性剂或强离子剂可使细胞裂解、蛋白质和多糖沉淀,缓冲液中的一些金属离子螯合剂( EDTA 等) 可螯合对核酸酶活性所必须的金属离子Mg2+ 、Ca2+ ,从而抑制核酸酶的活性,保护核酸不被降解。
(3) 酶作用:主要是通过加入溶菌酶或蛋白酶(蛋白酶K、植物蛋白酶或链酶蛋白酶) 以使细胞破裂,核酸释放。蛋白酶还能降解与核酸结合的蛋白质,促进核酸的分离。其中溶菌酶能催化细菌细胞壁的蛋白多糖N-乙酰葡糖胺和N-乙酰胞壁酸残基间的β-(1 ,4) 键水解。蛋白酶K能催化水解多种多肽键,其在65 ℃及有EDTA、尿素(1～4mol/ L) 和去污剂(0. 5 %SDS 或 1 %Triton X-100) 存在时仍保留酶活性,这有利于提高对高分子量核酸的提取效率。在实际工作中,酶作用、机械作用、化学作用经常联合使用。具体选择哪种或哪几种方法可根据细胞类型、待分离的核酸类型及后续实验目的来确定。

2. 酶处理:在核酸提取过程中,可通过加入适当的酶使不需要的物质降解,以利于核酸的分离与纯化。如在裂解液中加入蛋白酶(蛋白酶K 或链酶蛋白酶) 可以降解蛋白质,灭活核酸酶(DNase 和RNase) ,DNase 和RNase 也用于去除不需要的核酸。

3. 核酸的分离与纯化:核酸的高电荷磷酸骨架使其比蛋白质、多糖、脂肪等其他生物大分子物质更具亲水性,根据它们理化性质的差异,用选择性沉淀、层析、密度梯度离心等方法可将核酸分离、纯化。(1) 酚提取/ 沉淀法:核酸分离的一个经典方法是酚∶氯仿抽提法。细胞裂解后离心分离含核酸的水相,加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25 ∶24 ∶1 体积) 混合液。依据应用目的,两相经漩涡振荡混匀(适用于分离小分子量核酸) 或简单颠倒混匀(适用于分离高分子量核酸) 后离心分离。疏水性的蛋白质被分配至有机相,核酸则被留于上层水相。酚是一种有机溶剂,预先要用STE 缓冲液饱和,因未饱和的酚会吸收水相而带走一部分核酸。酚也易氧化发黄,而氧化的酚可引起核酸链中磷酸二酯键断裂或使核酸链交联;故在制备酚饱和液时要加入82羟基喹咛,以防止酚氧化。氯仿可去除脂肪,使更多蛋白质变性,从而提高提取效率。异戊醇则可减少操作过程中产生的气泡。核酸盐可被一些有机溶剂沉淀,通过沉淀可浓缩核酸,改变核酸溶解缓冲液的种类以及去除某些杂质分子。典型的例子是在酚、氯仿抽提后用乙醇沉淀,在含核酸的水相中加入p H5. 0～5. 5 ,终浓度为0. 3M 的NaOAc 或KOAc 后,钠离子会中和核酸磷酸骨架上的负电荷,在酸性环境中促进核酸的疏水复性。然后加入2～2. 5 倍体积的乙醇,经一定时间的孵育,可使核酸有效地沉淀。其他的一些有机溶剂[ 异丙醇、聚乙二醇( PEG) 等]和盐类(10. 0mol/ L 醋酸铵、8. 0mol/ L 的氯化锂、氯化镁和低浓度的氯化锌等) 也用于核酸的沉淀。不同的离子对一些酶有抑制作用或可影响核酸的沉淀和溶解, 在实际使用时应予以选择。经离心收集,核酸沉淀用70 %的乙醇漂洗以除去多余的盐分,即可获得纯化的核酸。(2) 层析法:层析法是利用不同物质某些理化性质的差异而建立的分离分析方法。包括吸附层析、亲和层析、离子交换层析等方法在内的层析法。因分离和纯化同步进行,并且有商品试剂盒供应,而被广泛应用于核酸的纯化。在一定的离子环境下,核酸可被选择性地吸附到硅土、硅胶或玻璃表面而与其他生物分子分离。另外一些选择性吸附方法以经修饰或包被的磁珠作为固相载体,磁珠可通过磁场分离而无需离心,结合至固相载体的核酸可用低盐缓冲液或水洗脱。该法分离纯化核酸,具有质量好、产量高、成本低、快速、简便、节省人力以及易于实现自动化等优点。

玻璃粉或玻璃珠被证实为一种有效的核酸吸附剂。在高盐溶液中,核酸可被吸附至玻璃基质上,离液盐碘化钠或高氯酸钠可促进DNA 与玻璃基质的结合。Dederich 等用酸洗玻璃珠分离纯化核酸,获得高产量的质粒DNA。在该方法中,细胞在碱性环境下裂解,裂解液用醋酸钾缓冲液中和后,直接加至含异丙醇的玻璃珠滤板,被异丙醇沉淀的质粒DNA 结合至玻璃珠,用80 %乙醇真空抽洗除去细胞残片和蛋白质沉淀。最后用含RNase A 的TE 缓冲液洗脱与玻璃珠结合的DNA ,获得的DNA 可直接用于测序。

Elkin 等使用羧化磁珠分离纯化质粒DNA。该法在细胞裂解后,离心分离含质粒的水相,再加入羧化的磁粒,然后用 PEG/ NaCl 沉淀,使目的DNA 吸附至磁珠,最后磁场分离被吸附的DNA ,经乙醇洗涤,用水洗脱,可获得高产量的适用于毛细管测序的模板DNA。

也有用铁粒为固相支持物,经磁场分离而纯化质粒DNA 的报道。细菌用溶菌酶2煮沸法裂解,质粒被释放至悬浮液中, 加铁珠捕获,用磁场使铁珠分离,经漂洗后用水洗脱质粒,可获得高产量、测序级的质粒DNA。
亲和层析是利用待分离物质与它们的特异性配体间所具有的特异性亲和力来分离物质的一类层析方法。Chandler 等报道了一种用肽核酸(PNA) 分离核酸的方法。PNA 是一类以 N-(2-氨乙基)2甘氨酸结构单元为骨架的DNA 类似物,可作为纯化皮克(pg) 级核糖体DNA ( rDNA) 和核糖体RNA ( rRNA) 的试剂。在该方法中,以生物素标记的肽核酸(peptide nucleic acids ,PNAs) 为探针,以包被了抗生蛋白链菌素的磁珠作为固相载体。PNA 探针在高盐环境下, 与目的核酸(DNA 或 RNA) 混合,经煮沸、冰浴、温育杂交步骤后,直接加入包被了抗生蛋白链菌素的顺磁性颗粒,经静置捕获PNA-核酸杂交体,水洗而获得纯化的核酸。
Schluep 等亦基于亲和层析原理,采用一种三螺旋体DNA 的方式进行质粒DNA 的分离。三螺旋体DNA 由同质嘌呤

2 同质嘧啶双螺旋链与同质嘧啶单链组成,单链上的T 识别A ·T 碱基,对形成T ·A ·T 三联体,质子化的单链胞嘧啶 (C+ ) 识别G·C 碱基对形成C ·G·C 三联体。在适当的条件下,三螺旋体的结合具有高特异性和高稳定性。将配体聚嘧啶寡核苷酸链通过化学方法连接至Sephacryl S21000 SF 颗粒上形成亲和载体。当含目的序列的质粒DNA 溶液与其混合时,在酸性环境(p H 4. 5～5. 5) 下,质粒结合至亲和载体颗粒上,溶液中高浓度的NaCl 可稳定三联体形式并减少与蛋白质、细胞DNA 的非特异性结合。经一段时间反应后,颗粒悬浮液被加至一层析柱,用适当的洗脱液改变p H 值至碱性环境,可使三联体解聚,质粒被洗脱。经该法分离质粒DNA ,质粒产量可达到加入量的62 %。
也有用Schizophyllan ( SPG) 制备亲和层析柱分离纯化 RNA 的报道。SPG是一种β21 ,32葡聚糖,在低温下,含RNA 的流动相通过层析柱,Poly (C) 和poly (A) 与SPG通过氢键和疏水作用形成复合物而被吸附于柱上,然后通过改变缓冲液成分,将被吸附的RNA 洗脱。亲和层析应用于核酸分离与纯化的另一个例子是用oligo ( dT)2纤维素层析法从真核细胞总 RNA 中分离带poly (A) 尾的mRNA。在该方法中,短链oligo (dT) 通过其52磷酸与纤维素的羟基共价结合而连接至纤维素介质上。当样本经过oligo (dT) 柱时,mRNA 因其poly (A) 可与短链oligo (dT) 形成稳定的RNA2DNA 杂合链,而被连接到纤维素介质上,从而与其他RNA 分离。在适当的条件下(低盐、加热) ,poly (A) RNA 可被水洗脱而得以纯化。

离子交换层析以具有离子交换性能的物质为固定相,其与流动相中的离子能进行可逆交换,从而能分离离子型化合物。用离子交换层析纯化核酸是因为核酸为高负电荷的线性多聚阴离子,在低离子强度缓冲液中,利用目的核酸与阴离子交换柱上功能基质间的静电反应,使带负电荷的核酸结合到带正电的基质上,杂质分子被洗脱。然后提高缓冲液的离子强度,将核酸从基质上洗脱,经异丙醇或乙醇沉淀即可获得纯化的核酸。该法适用于大规模核酸的纯化。Ferreira 等用含0. 5 M NaCl 的TE 缓冲液平衡层析柱,加样后用含1 M NaCl 的TE 缓冲液洗脱核酸,获得了很好的分离效果。

(3) 密度梯度离心法:密度梯度离心也用于核酸的分离和分析。双链DNA、单链DNA、RNA 和蛋白质具有不同的密度,因而可经密度梯度离心形式形成不同密度的纯样品区带, 该法适用于大量核酸样本的制备,其中氯化铯2溴化乙锭梯度平衡离心法被认为是纯化大量质粒DNA 的首选方法。氯化铯是核酸密度梯度离心的标准介质,梯度液中的溴化乙锭与核酸结合,离心后形成的核酸区带经紫外灯照射,产生荧光而被检测,用注射针头穿刺回收后,通过透析或乙醇沉淀除去氯化铯而获得纯化的核酸。

② p h3.5，四种核苷酸所带的电荷数是怎么算的

四种核苷酸所带的电荷数是怎么算的
① 电泳分离4种核苷酸时应取pH3.5 的缓冲液，在该pH时，这4种单核苷酸之间所带负电荷差异较大，它们都向正极移动，但移动的速度不同，依次为：UMP>GMP>AMP>CMP；
② 应取pH8.0，这样可使核苷酸带较多负电荷，利于吸附于阴离子交换树脂柱。虽然pH 11.4时核苷酸带有更多的负电荷，但pH过高对分离不利。
③ 当不考虑树脂的非极性吸附时，根据核苷酸负电荷的多少来决定洗脱速度，则洗脱顺序为CMP>AMP> GMP > UMP，但实际上核苷酸和聚苯乙烯阴离子交换树脂之间存在着非极性吸附，嘌呤碱基的非极性吸附是嘧啶碱基的3倍。静电吸附与非极性吸附共同作用的结果使洗脱顺序为：CMP> AMP > UMP >GMP。

③ 凝胶的生物

生物分子下游纯化的对象一般包括蛋白、酶、重组蛋白、单抗、抗体及抗原、肽类、病毒、核酸等。纯化前首先需要测定生物分子的各物理和化学特性，然后通过实验选择出最有效的纯化流程。
1.测定——分子量、PI
当目标蛋白的物理特性如分子量、PI等都不清楚时，可用PAGE电泳方法或层析方法加以测定。分离范围广阔的Superose HR预装柱很适合测定未知蛋白的分子量。用少量离子交换介质在多个含不同PH缓冲液的试管中，可简易地测出PI，并选择纯化用缓冲液的最佳PH。
2.选择——层析方法
若对目标蛋白的特性或样品成分不太了解，可尝试几种不同的纯化方法：
一 使用最通用的凝胶过滤方法，选择分离范围广阔的介质如Superose、Sephacryl HR依据分子量将样品分成不同组份。
二 用含专一配体或抗体的亲和层析介质结合目标蛋白。亦可用各种活化偶联介质偶联目标蛋白的底物、受体等自制亲和介质，再用以结合目标蛋白。一步即可得到高纯度样品。
三 体积大的样品，往往使用离子交换层析加以浓缩及粗纯化。高盐洗脱的样品，可再用疏水层析纯化。疏水层析利用高盐吸附、低盐洗脱的原理，洗脱样品又可直接上离子交换等吸附性层析。两种方法常被交替使用于纯化流程中。
3.纯化——大量粗品
处理大量原液时，为避免堵塞柱子，一般使用sepharose big beads、sepharoseXL、sepharose fast flow等大颗粒离子交换介质。扩张柱床吸附技术利用多种STREAMLINE介质，直接从含破碎细胞或组织萃取物的发酵液中俘获蛋白。将离心、超滤、初纯化结合为一。提高回收率，缩短纯化周期。
4.纯化——硫酸氨样品
硫酸氨沉淀方法常被用来初步净化样品，经处理过的样本处于高盐状态下，很适合直接上疏水层析。若作离子交换，需先用Sephadex G-25脱盐。疏水层析是较新技术，随着介质种类不断增多，渐被融入各生产工艺中。利用Hitrap HIC Test Kit 和RESOURCE HIC Test Kit可在八种疏水介质中选择最适合介质及最佳的纯化条件。低盐洗脱的样品可稍加稀释或直接上其它吸附性层析。
5.纯化——糖类分子
固化外源凝订素如刀豆球蛋白、花生、大麦等凝集素，可结合碳水化合物的糖类残基，很适合用作分离糖化细胞膜组份、细胞、甚至亚细胞细胞器，纯化糖蛋白等。两种附上外源凝集素的Sepharose 6MB亲和层析介质，专为俘获整个细胞或大复合物，如膜囊等。
6.纯化——膜蛋白
膜蛋白分离常使用去污剂以保持其活性。离子性去污剂应选用与目标蛋白相反电荷者，避免在作离子交换时和目标蛋白竞争交换介质，藉此除去去污剂。非离子性去污剂可以疏水层析除去。
7.纯化——单抗、抗原
单抗多为IgG.来源主要是腹水和融合瘤培养上清液。在培养前除去IgG.重组蛋白A介质Mabselect和rProtein A Sepharose FF对IgG有更高的载量和专一性，基团脱落更少。脱落的rProtein A用离子交换Q Sepharose HP或凝胶过滤Superdex 200，很容易去除。
疏水层析Phenyl Sepharose HP亦很适合纯化IgG.宿主抗体和污染IgG可用凝胶过滤Superdex 200在精细纯化中去除。
纯化IgG抗原最有效的方法是用活化偶联介质如CNBr、NHs activated Sepharose FF偶联IgG，再进一步获取IgG抗原。
HiTrap IgM是用来纯化融合瘤细胞培养的单抗IgM，结合量达5mg IgM.HiTrap IgY是专门用来纯化IgY，结合量达100mg纯IgY.
8.纯化——重组蛋白
重组蛋白在设计、构建时应已融入纯化构想。样品多夹杂了破碎细胞或溶解产物，扩张柱床吸附技术STREAMLINE便很适合做粗分离。Amersham biosciences提供三个快速表达、一步纯化的融合系统。
一 GST融合载体使要表达的蛋白和谷胱甘肽S转移酶一起表达，然后利用Glutathione Sepharose 4B作亲和层析纯化，再利用凝血酶或因子Xa切开。
2. 蛋白A融合载体使要表达的蛋白和蛋白A的IgG结合部位融合在一起表达，以IgG Sepharose 6 FF纯化。
二 含组氨酸标记（Histidine-tagged）的融合蛋白可用Chelating Sepharose FF螯合Ni2+金属，在一般或变性条件（8M尿素）下透过组氨酸螯合融合蛋白。HisTrap试剂盒提供整套His-Tag蛋白的纯化方法。
9.纯化——包涵体蛋白
包涵体蛋白往往需溶于6M盐酸胍或8M尿素中。一般包涵体蛋白样品的纯度越高，复性效果越好。SOURCE 30 RPC反相层析介质很适合纯化复性前的粗品，并可以1MnaOH重生。此方法纯化后的包涵体蛋白，复性回收率明显提高。
10.包涵体蛋白固相复性
许多文献报导将包涵体蛋白在变性条件下固定（吸附）在层析介质上，一般用各种Sepharose FF离子交换层析介质。而且无需大量稀释样品，并将复性和初纯化合二为一，大大节省时间及提高回收率。
固相复性方法也被用于以HiTrap Chelating金属螯合层析直接复性及纯化包涵体形式表达的组氨酸融合蛋白；以HiTrap Heparin肝素亲和层析直接复性及纯化包涵体形式表达的含多个赖氨酸的融合蛋白。两种亲和层析预装柱均可反复多次重复使用，比一般试剂盒更方便、耐用。
11.纯化——中草药有效成分
中药的化学成分极其复杂。例：如用甲醇分离黄酮甙，三糖甙先被洗下来，二糖甙其次，单糖甙随后，最后是甙元。Sephadex LH-20可使用水、醇、丙酮、氯仿等各种试剂，广泛用于各种天然产物的分离，包括生物碱、甙、黄酮、醌类、内脂、萜类、甾类等。
生物碱在酸性缓冲液中带正电，成为盐，HiTrap SP阳离子交换层析柱可以分离许多结构非常近似的生物碱。相反，黄酮、蒽醌、皂甙、有机酸等可溶于偏碱的缓冲液中，在HiTrap Q阴离子交换柱上分离效果良好。
一般多糖纯化大多使用分子筛如Sephadex，Sephacryl.若分子量在600KD以下，并需更高分辨率，可选择新一代的Superdex.一般植物可能含水溶性、酸溶性、碱溶性多种多糖。SOURCE5、15、30RPC反相层析也很适合各种中药有效成分的检测、分离和放大制备。由于中药的成分非常复杂，SOURCE反相层析可用范围为PH1-14 ，并可用1M NaOH，1M HCL清洗、再生。比传统硅胶反相层析更易于工艺优化及在位清洗，寿命也更长。
12.纯化——肽类
肽类的来源有天然萃取，合成肽和重组肽三种。肽容易被酶降解，但可从有机溶剂或促溶剂中复性，所以多以高选择性的反相层析如SOURCE 30RPC、SOURCE 15RPC、SOURCE 5RPC或离子交换Minibeads、Monobeads作纯化。Superdex Peptide HR是专为肽分子纯化设计的凝胶过滤预装柱，能配合反相层析做出更精美的肽图。肽分子制备可用离子交换配合凝胶过滤Superdex 30 PG。医学都市多功能
13.纯化——核酸、病毒
核酸的纯化用于去除影响测序或PCR污染物等研究。核酸可大致上分为质粒DNA、噬菌体DNA和PCR产物等。病毒也可视作核酸大分子，和质粒DNA一样，可用分离大分子的Sephacry S-1000 SF、Superose或Sepharoce 4FF凝胶过滤介质去除杂蛋白，再配合离子交换如Mono Q、 SOURCE Q分离核酸。
14.纯化——寡核苷酸寡酸苷酸
多应用在反义（anti-sense）DNA、RNA测序、PCR和cDNA合成等研究。合成后含三苯甲基的寡核苷酸以阴离子交换的Mono Q或快速低反压的SOURCE Q在PH12下可除副产物，并避免凝集和保护基的脱落。载量大大高过反相层析，可用做大量制备。不含三苯甲基的失败序列可用反相柱ProRPC去除。
15.脱盐、小分子去除
使用凝胶过滤介质Sephadex G10，G15，G25，G50等去除小分子，效率高，处理量可达床体积30%.只需在进样后收集首1/3-1/2柱体积的洗脱液，HiPrep Desalting（26ml）可在数分钟为多至10ml样品脱盐。
16.疫苗纯化
使用凝胶过滤介质Sepharose 4FF纯化疫苗，去除培养基中的杂蛋白，处理量可大于床体积10%.柱高一般40-70cm，整个过程约半至一小时。使用此法生产的疫苗品种有乙肝、狂犬、出血热、流感、肺结核、小儿麻痹疫苗等。分子量较小的疫苗可使用Sephacryl S-500HR，如甲肝疫苗等。
17.抗生素聚合物分析
中国药典从2000年版起要求抗生素头孢曲松钠需要找出聚合物占产品的白分比，规定使用Sephadex G10凝胶过滤法测定。
18.纯化-基因治疗用病毒载体
SORRCE 15Q
19.纯化-基因治疗用质粒
Q Sepharose XL，SOURCE 15Q，STREAMLINE Q，Sephacryl S500，Plasmidselect 在下游纯化中，可应用不同层析技术在纯化生物分子的同时，去除各种污染物。 1.去除——内毒素
内毒素又称热原。含脂肪A、糖类和蛋白，是带负电的复合大分子。
内毒素的脂肪A部份有很强的疏水性。但在高盐下会凝集，无法上疏水层析。利用疏水层析试验盒（17-1349-01）可选择结合目标蛋白的介质而去除内毒素。
内毒素与阴离子交换介质Q或DEAE Sepharose Fast Flow有较强结合。可在洗脱目标蛋白后用高盐缓冲液或NaOH去除。
利用CNBr或NHS Sepharose FF可偶联内毒素底物如LAL，PMB，自动成亲合层析介质结合内毒素。内毒素经常是多聚体，凝胶过滤层析可有效地将之去除。
2.去除——蛋白中的核酸
大量核酸增加样本黏度，令区带扩张，反压增加，降低分辨率和流速。药审和食检对核酸含量也有严格限制。
胞内表达蛋白的核酸问题尤其严重。核酸带阴电荷，在初步纯化时利用阳离子交换介质如STREAMLINESP，SP Sepharose Big Beads，SP或CM Sepharose FF，SP SepharoseXL结合目标蛋白，可除去大量核酸。
核酸在高盐下会和蛋白解离，疏水层析介质很适合用来结合目标蛋白，在纯化蛋白的同时去除核酸。
利用核酸酶将核酸切成小片断，用凝胶过滤做精细纯化时便很容易去除了。
3.去除——病毒和微生物
病毒和微生物可成为病原，应尽量减除。结合不同层析技术，使用注射用水，用NaOH定期进行仪器和凝胶的在位消毒和在位清洗，皆可避免污染物增加。
病毒大都有脂外壳。可用与目标蛋白电荷相反的S/D（solvent/detergent）处理，使病毒失活，如Triton和Tween.再用适当的离子交换介质如CM Sepharose FF结合目标蛋白，去除S/D.
其它污染物可以改变pH和离子强度使其从目标分子中解离或失活，凝胶过滤介质Superdex及多种吸附性介质，SOURCE都是很好的精细纯化介质，可去除多种微量污染物。 凝胶是指颗粒大小在1埃到10埃之间的混合物。高分子溶液和某些溶胶，在适当的条件下，整个体系会转变成一种弹性的半固体状态的稠厚物质，失去流动性。这种现象称为胶凝作用,所形成的产物叫做凝胶或冻胶.
“气凝胶”是指分散系为气态的，如：云，雾等，“固凝胶”有烟水晶等，“液凝胶”就是呈液态的胶体，如氢氧化铁胶体 。

④ 利用吸附柱纯化DNA的原理是什么

看了楼上一些回答，也是学生命类的吧？
专一性的吸附柱用的是和基因探针一样的原理，人工合成待纯化的DNA的一端一定长度序列的反义链，并加到吸附柱上，当混合物经过时，需要分离的DNA分子与柱上的探针结合，被留下，其余的通过。
这样的离心吸附柱可以高效、专一地与DNA片段结合,同时最大限度除去蛋白质、离子及引物小片段等杂质。
这样将寡核苷酸片断结合到柱上，可回收50
bp-50
kb
DNA片段。适用于
DNA溶液中只有单一DNA片段或溶液中所有DNA片段都需同时回收的情况。
非专一性的和楼上说的差不多。
纯化柱是表面偶联有二乙胺乙醇(DEAE)的亲水性树脂.DNA纯化原理为DNA磷酸基带负电荷,
DEAE带正电荷,
DNA可以在0.1～1.4
mol．L-1的相当大的盐浓度范围内仍与DEAE
结合,
当低盐QBT溶液平衡纯化柱后,
即可加样,
用中等盐浓度的QC洗去RNA和其他杂质,
最后用高盐浓度的QF将DNA洗脱下来。
由于传统的离子交换范围仅在0.4
mol．L-1以内,
使杂质和DNA
洗脱范围十分接近,
难于达到满意的纯化效果.
但该柱一经使用,
6h后纯化效力即开始下降。估计可能得原因有二,
一是树脂表面亲水性强,
极易吸附蛋白,
糖类,
RNA等水容物,
从而使原装柱经几次循环后吸附过多杂质,
影响了DEAE吸附DNA的能力,
同时杂质阻塞树脂间隙,
使液体流过柱子的速度明显变慢,
二是DEAE与树脂的偶联并不十分稳定,
在一经使用后的液体环境中,容易逐步解离.

⑤ 电泳分离四种核苷酸时，通常将缓冲液调到什么ph

①
电泳来分离4种核苷源酸时应取pH3.5
的缓冲液，在该pH时，这4种单核苷酸之间所带负电荷差异较大，它们都向正极移动，但移动的速度不同，依次为：UMP>GMP>AMP>CMP；
②
应取pH8.0，这样可使核苷酸带较多负电荷，利于吸附于阴离子交换树脂柱。虽然pH
11.4时核苷酸带有更多的负电荷，但pH过高对分离不利。
③
当不考虑树脂的非极性吸附时，根据核苷酸负电荷的多少来决定洗脱速度，则洗脱顺序为CMP>AMP>
GMP
>
UMP，但实际上核苷酸和聚苯乙烯阴离子交换树脂之间存在着非极性吸附，嘌呤碱基的非极性吸附是嘧啶碱基的3倍。静电吸附与非极性吸附共同作用的结果使洗脱顺序为：CMP>
AMP
>
UMP
>GMP。

⑥ 在什么pH时电泳，分离效果最好

①
电泳分离4种核苷酸时应取ph3.5
的缓冲液，在该ph时，这4种单核苷酸之间所带负电荷差异较大，它们都向正极移动，但移动的速度不同，依次为：ump>gmp>amp>cmp；
②
应取ph8.0，这样可使核苷酸带较多负电荷，利于吸附于阴离子交换树脂柱。虽然ph
11.4时核苷酸带有更多的负电荷，但ph过高对分离不利。
③
当不考虑树脂的非极性吸附时，根据核苷酸负电荷的多少来决定洗脱速度，则洗脱顺序为cmp>amp>
gmp
>
ump，但实际上核苷酸和聚苯乙烯阴离子交换树脂之间存在着非极性吸附，嘌呤碱基的非极性吸附是嘧啶碱基的3倍。静电吸附与非极性吸附共同作用的结果使洗脱顺序为：cmp>
amp
>
ump
>gmp。

⑦ 将四种核苷酸吸附于阴离子交换柱上时，应将溶液调到什么 ph

① 电泳分离4种核苷酸时应取pH3.5 的缓冲液，在该pH时，这4种单核苷酸之间所带负电荷差异较大，回它们都向正极答移动，但移动的速度不同，依次为：UMP>GMP>AMP>CMP；
② 应取pH8.0，这样可使核苷酸带较多负电荷，利于吸附于阴离子交换树脂柱。虽然pH 11.4时核苷酸带有更多的负电荷，但pH过高对分离不利。
③ 当不考虑树脂的非极性吸附时，根据核苷酸负电荷的多少来决定洗脱速度，则洗脱顺序为CMP>AMP> GMP > UMP，但实际上核苷酸和聚苯乙烯阴离子交换树脂之间存在着非极性吸附，嘌呤碱基的非极性吸附是嘧啶碱基的3倍。静电吸附与非极性吸附共同作用的结果使洗脱顺序为：CMP> AMP > UMP >GMP。

⑧ 请提供有关高中生物竞赛生物化学的试题 拜托啦 急用

一、选择题

1、识别密码子GCU的反密码子为______

2、拓扑异构酶I的功能为______

3、真核生物RNA聚合酶I转录的RNA为______

4、假如将15N标记的大肠杆菌在14N培养基种生长三代，提取其DNA 进行CsCl密度梯度离心，其15N，14N杂和DNA分子与纯14N-DNA分子之比为______

5、多数生物体内核糖核苷酸还原成脱氧核糖核苷酸发生在______

6、氯霉素的抗菌作用是由于它______

7、真核生物体内多肽链合成的第一个氨基酸为______

8、用强酸性阳离子交换树脂分离氨基酸混合物时（PH3.0上柱）与树脂结合最牢的是______

9、竞争性抑制剂使Vmax______，Km______

10、操纵子是______

11、正协同效应的别构酶是Rs______

12、用人工合成含有两种碱基的多核苷酸进行体外翻译，最可能形成的产物为______

13、甲状腺素的作用是通过______

14、有一大肠杆菌突变株，其DNA聚合酶III的3‘-5’核酸外切酶活性缺陷，它将表现出______

15、糖异生的生理作用______

16、从乳酸经糖异生形成葡萄糖共消耗______ATP

17、用于多肽链专一性短裂方法中选择性最强的是______

18、三羧酸循环中所有酶都位于线粒体的基质，除了______

19、糖原是动物体内的多糖，它的结构特点是______

20、三羧酸循环中异柠檬酸脱氢酶催化的反应，被______影响

21、鱼藤酮阻断呼吸链是由于______

22、厌氧条件下葡萄糖酵解产物是______

23、油脂酰CoA通过β-氧化途径和TCA途径分解成CO2和H2O，共产生ATP数为______

24、具有不同氧化水平的一碳单位载体是______

25、糖原分解的调控______

二、是非题

1、因为α螺旋是蛋白质构象稳定的重要因素，因此蛋白质活性部位通常在α螺旋区的表面（ ）

2、糖皮质激素和肾上腺素都是提高血糖的激素（ ）

3、酶的Km值是酶的特征常数，它不随测定的PH和温度而改变（ ）

4、真核生物mRNA分子两端都有3‘-OH（ ）

5、原核生物DNA为半不连续复制，真核生物DNA为全不连续复制（ ）

6、别构酶动力学曲线的特点都是呈S形曲线（ ）

7、多顺反子mRNA含有多个起始密码子和终止密码子（ ）

8、两条肽链反平行的β-折叠构象比平行的稳定（ ）

9、用SDS-PAGE电泳法测定蛋白质分子量是根据蛋白质分子所带的电荷量而定（ ）

10、紫外线照射可引起DNA两条互补链上的T之间形成二聚体（ ）

三、写出下列缩写的生化名称

ACTH Cot1/2 RQ FADH2 LDL

四、写出下列化合物的结构式

1、精氨酸

2、维生素C（还原型）

3、cAMP

4、 蔗糖（透视式）

5、 ψ

6、肌酸

7、分枝酸

8、 卵磷脂

9、11顺视黄醛

10、甲状腺素

五、填空题

1、PH8.0时，ATP带____电荷。

2、tRNA的二级结构为____形，三级结构为____形。

3、NAD+和NADP+还原时，在____处有一个吸收峰。

4、当多肽键存在____残基时，α螺旋就被中断。

5、糖原合成酶D的别构调控物是____.

6、脂肪酸还原力的主要来源来是____途径。

7、丙酮酸脱氢酶复合物的调节控制的方式主要有____，____和____.

8、核酸复制时，DNA聚合酶沿模板链____方向移动；转录时，RNA聚合酶沿模板链____方向移动；翻译时，核糖体沿模板链____方向移动。

9、预使酶反应速度达到Vmax的80%，此时底物浓度应是此酶Km值的____.

10、在厌氧酵解中每消耗1克分子葡萄糖需用2克分子无机磷，催化剂用无机磷反应的酶是____.

11、从乙酰CoA合成胆固醇的限速步骤是从____形成____，由____酶催化。

12、催化氨基酸联合脱氢酶是____和____.

13、维生素D的活性形式是____.

14、细菌的DNA连接酶以____为能量来源，动物细胞和T4噬菌体的DNA连接酶以____为能源。

15、在正常生理条件下，蛋白质分子中____和____侧链几乎完全带正电荷。

16、蛋白质生物合成时，生成肽键的能量来自____，核糖体在mRNA上移动的能量来源为____.

17、胰凝乳蛋白酶的亲和标记试剂是____，它作用于该酶活性中心的____.

18、不能进行糖异生的氨基酸是____.

六、分析和计算题

1、有一氨基酸组成为Ala，Lys，Phe，的七肽，将它与FDNS反应，经酸水解后，生成游离的DNP-Ala.将它用胰蛋白酶酶解，则得到一个三肽和一个四肽，它们的组成分别为：3Ala，Phe和Lys，2Ala.将它用胰凝乳蛋白酶酶解，则生成一个六肽与一个游离的Ala.试写出其氨基酸顺序。

2、今有以下4种蛋白质的混合物：（1）分子量12，000，pI=10；（2）分子量62，000，pI=4；（3）分子量28，000，pI=7；（4）分子量9，000，pI=5；若不其它因素，当它们

（A）流过DEAE-纤维素阴离子交换柱，用线性盐梯度洗脱时；（B）流经Sephadex G-50凝胶过 滤柱时，这些蛋白质的洗脱顺序如何？

3、若用14C标记 下列化合物，经一次TCA循环后，试问14C出现在什么化合物的什么部位上？

(1)H310C____C____COO- (2)H3C-C____14COO-
|| ||
O O

4、假如突变导致脂肪细胞中过多产生依赖cAMP的蛋白激酶，试问影响脂肪酸代谢的突变效应是什么？

5、已知cccDNA每结合一个嵌合染料菲啶溴红分子，双螺旋将解开26.左右，有一DNA制剂，加入菲啶溴红使其沉降系数达到最低值，此时每个核苷酸平均结合菲啶溴红分子树为0.07，求此DNA制剂的负超螺旋密度数值。

6、叶绿体在充分光照，25.C，PH7.0的条件下，ATP，ADP，和Pi浓度分别为100，1和100uM

（1）计算合成1克分子ATP需要多少自由能。

（2）为了合成ATP一对电子传递的最低电位是多少？

7、某酶的Km为4.0X10-5M，Vmax=24微克分子/升/分钟，计算出当底物浓度为2X10-4M，非竞争性抑制剂浓度为6.0X10-4M，如Ki为3.0X10-4M时的抑制百分数。

⑨ 能不能用电泳的方法分离核酸，为什么

① 电泳分离4种核苷酸时应取pH3.5 的缓冲液，在该pH时，这4种单核苷酸之间所带负电荷差异较大，它们都向正极移动，但移动的速度不同，依次为：UMP>GMP>AMP>CMP；
② 应取pH8.0，这样可使核苷酸带较多负电荷，利于吸附于阴离子交换树脂柱。虽然pH 11.4时核苷酸带有更多的负电荷，但pH过高对分离不利。
③ 当不考虑树脂的非极性吸附时，根据核苷酸负电荷的多少来决定洗脱速度，则洗脱顺序为CMP>AMP> GMP > UMP，但实际上核苷酸和聚苯乙烯阴离子交换树脂之间存在着非极性吸附，嘌呤碱基的非极性吸附是嘧啶碱基的3倍。静电吸附与非极性吸附共同作用的结果使洗脱顺序为：CMP> AMP > UMP >GMP。